摘　要　流式細胞分析(flow cytometry FCM) ,即流式細胞術,是用流式細胞儀(flow cytome-ter FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現代分析技術。它是眾多不同學術背景、不同科技領域相結合的結晶。它是物理學、生物學、醫學等綜合運用的產物。本文就流式細胞術的發展歷史、流式細胞儀的原理及在各領域的應用進行綜述,闡明現代流式細胞術由于結合單克隆抗體技術、定量熒光細胞化學技術,使其在生物學、臨床醫學、藥物學、材料學等眾多研究領域中的應用有更加突飛猛進的發展。

關鍵詞　流式細胞術(FCM) 　歷史　原理　應用

流式細胞分析(flow cytometry FCM) 即流式細胞術,是用流式細胞儀(flow cytometer FCM) 測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現代分析技術。它凝結眾多不同學術背景、不同科研領域科學家的心血。從流式細胞術的發明、發展直到今天在各個領域應用的拓展,每一步都是諸如電子技術、流體力學、計算機科學、激光技術、生物學、生物技術、高等數學、臨床醫學、分子生物學、有機化學和生物物理學等學科知識綜合運用的結晶。現代流式細胞術更是由于它結合單克隆抗體技術、定量細胞化學技術和定量熒光細胞化學,使其在生物學、臨床醫學、藥物學、材料學等眾多研究領域中的應用有更加突飛猛進的發展。流式細胞術的發展史也就是各個相關學科的發展史的縮影。

1 　流式細胞術的發展歷史

1930 年,Casperrsson 和Thorell 開始致力于細胞的計數;1934 年,Moldaven 是世界上最早設想使細胞檢測自動化的人,他試圖用光電儀記錄流過1 根毛細管的細胞數量;1936 年,Caspersson 等引入顯微光度術;1940 年,Coons 提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內的特定蛋白;1947 年,Guclcer 運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數器;1949 年,Coulter 提出在懸液中計數粒子的方法并獲得專利;1950 年,Caspersson 用顯微分光光度計在紫外(UV) 和可見光光譜區檢測細胞;1953 年,Croslannd2Taylor 應用分層鞘流原理,成功地設計紅細胞光學自動計數器;1953年,Parker 和Hutcheon 描述一種全血細胞計數器裝置,成為流式細胞儀的雛形; 1954 年, Beirne 和Hutchcon 發明光電粒子計數器;1959 年,B 型Coulter計數器問世; 1965 年, Kamemtsky 等提出兩個設想:(1) 用分光光度計定量細胞成分; (2) 結合測量值對細胞進行分類; 1967 年, Kamemtsky 和Melamed 在.Moldaven 的方法基礎上提出細胞分選的方法;1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事們在LosALmos ,NM(即現在的National Flow Cytometry Resource Labs) 發明第一臺熒光檢測細胞計;1972 年,Herzenberg 研制出一個細胞分選器的改進型,能夠檢測出經熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號; 1975 年,Kochler 和Milstein 提出單克隆抗體技術,為細胞研究中大量的特異性免疫試劑的應用奠定基礎。現今隨著光電技術的進一步發展,流式細胞儀已開始向模塊化發展,即它的光學系統、檢測器單元和電子系統都可以按照實驗要求隨意更換。進入21 世紀,流式細胞術已經日臻完善,成為分析細胞學領域中無可替代的重要工具。

2 　流式細胞儀的工作原理

流式細胞儀主要由4 部分組成:液流系統、光學系統、電子系統、分析系統。它只能檢測懸浮的單細胞或微粒的信號。一般是將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本,在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室,用不含細胞或微粒的緩沖液(又稱鞘液) 在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流成一定角度,使鞘液包繞著細胞或微粒高速流動,形成一個圓形的流束(即鞘流) ,待測細胞在鞘液的包裹下單行排列,依次通過流式細胞儀的檢測區域,經激發光激發后產生熒光信號。流式細胞儀通常以激光作為激發光源,經過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光束的照射下產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管( PMT) 接收。光散射信號在前向小角度進行檢測,稱為前向散射(forward～atter ,FSC) ,這種信號基本上反映細胞體積的大小;90°散射光又稱側向散射(side scatter ,SSC) ,是指與激光束2液流平面垂直的散射光,其信號強度可反映細胞部分結構的信息。熒光信號的接收方向與激光束垂直,經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表所測細胞膜表面抗原的強度或其細胞內、核內物質的濃度,經光電倍增管接收后可轉換為電信號,再通過模/ 數轉換器,將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機采集所測量到的各種信號進行計算處理,將分析結果顯示在計算機屏幕上,也可以打印出來,還可以數據文件的形式存儲在硬盤上,以備日后的查詢或進一步分析。檢測數據的顯示視測量參數的不同而有多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達,其x 軸為測量的散射光或熒光的強度(可以是線性軸,也可以選擇對數軸) ,縱軸為相對細胞數。一般來說,流式細胞儀坐標軸的分辨率有256 或1024 通道數,這視其模/ 數轉換器的分辨率而定。對于雙參數或多參數數據,既可以單獨顯示每個參數的直方圖,也可以選擇二維的散點圖、等高線圖或三維的立體視圖等。

流式細胞儀還可以對分析中的目的細胞進行分選提取,它通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體,可以產生高頻振蕩,使液流斷裂為均勻的液滴,待測細胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷,當帶電液滴通過電場,在電場的作用下發生偏轉,然后落入相應的收集器之中,從而實現細胞分選。流式細胞儀的分選速度從以往的5000 個/ s 提高到現在的25000 個/ s。

流式細胞術發展趨勢可歸納為: ①流式細胞儀從單純大型儀器發展為適應各種實際應用的便攜式、臺式、高分辨率、高質量分選的研究型流式細胞儀; ②對流式細胞術檢測熒光參數,從采用熒光單色、雙色分析發展為多色分析,目前最多可同時檢測15 種熒光信號; ③從檢測參數的相對定量發展為絕對定量; ④從檢測參數的手動人工分析發展為利用計算機軟件的自動分析; ⑤所采用的熒光試劑,從非配套試劑發展為配套的試劑盒試劑。而這一切,就要求流式細胞儀使用者和科研人員,一定要不斷地有意識地學習上述各門學科知識,只有這樣才能更好地將流式細胞術應用到生物醫學的臨床實踐和基礎科學研究工作中去。