1. cDNA產(chǎn)量的很低

　　可能的原因：

　　*RNA模板質(zhì)量低

　　*對mRNA濃度估計過高

　　*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足

　　*同位素磷32過期

　　*反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl

　　2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

　　*最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系

　　*與反應(yīng)起始時RNA的總量及純度有關(guān)

　　*建議在試驗中加入對照RNA

　　*第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進行PCR擴增時，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10

　　*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物(GSP)用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導致GSP無法與模板退火;或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進行有效延伸。

　　*目的mRNA中含有強的轉(zhuǎn)錄中止位點，可以試用以下方法解決：

　　a. 將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。

　　b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行第一鏈反應(yīng)。

　　3. 產(chǎn)生非特異性條帶

　　*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

　　*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴增將導致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。

　　*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

　　4. 產(chǎn)生彌散(smear)條帶

　　*在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高

　　*減少引物的用量

　　*優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)

　　*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

　　5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

　　*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

　　*對于長片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)

　　6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結(jié)果

　　*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉(zhuǎn)錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

　　*有可能是引物二聚體的條帶

　　7. 擴增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

　　*有可能是由于模板量過高而導致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進行二次擴增。

　　*另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。

　　8. SSⅢ與SSⅡ有何不同?

　　*具有更高的熱穩(wěn)定性(達50℃)

　　*具有更長的半衰期(達220分鐘)

　　*對PCR無抑制

　　*干冰運輸

　　*Tdt活性更低

　　9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript?

　　ThermoScript如果保存不當會引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。

　　10. 為什么使用基因特異性引物(GSP)?

　　GSP在擴增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄;隨機引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。

　　11. 什么情況下需要使用RNase H?

　　在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時

　　12. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：

　　目的 建議

　　RT與PCR使用不同的引物

　　或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　高靈敏度 一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　高特異性 含有適當?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)

　　高保真度 含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　長的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果 通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達到最佳結(jié)果

　　含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)

　　二、Generacer

　　1. 如何針對Generacer試劑盒設(shè)計基因特異性引物(GSP)?

　　使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計引物時需要注意以下幾點要求：

　　*50-70%的GC含量，以提高引物熔點(Tm)

　　*23-28個堿基長度，以提高引物特異性

　　*降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低

　　2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?

　　*加入Hela對照

　　*低質(zhì)量的RNA模板

　　*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成

　　*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR

　　*目的基因沒有表達，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因

　　*目的基因太長而不適合進行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進行PCR。

　　*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過高GC含量區(qū);使用高保真度和高延伸能力的酶進行PCR反應(yīng)。

　　3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶

　　RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

　　*GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會導致在擴增目的產(chǎn)物時得到無關(guān)產(chǎn)物。

　　*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結(jié)合會導致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。

　　*RNA降解。

　　*PCR管或試劑污染。

　　注意：雜帶一般是因為沒有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。

　　4. 得不到全長的5’RACE PCR產(chǎn)物

　　*CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。

　　*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量。

　　*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

　　二、Generacer

　　1. 如何針對Generacer試劑盒設(shè)計基因特異性引物(GSP)?

　　使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計引物時需要注意以下幾點要求：

　　*50-70%的GC含量，以提高引物熔點(Tm)

　　*23-28個堿基長度，以提高引物特異性

　　*降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低

　　2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?

　　*加入Hela對照

　　*低質(zhì)量的RNA模板

　　*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成

　　*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR

　　*目的基因沒有表達，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因

　　*目的基因太長而不適合進行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進行PCR。

　　*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過高GC含量區(qū);使用高保真度和高延伸能力的酶進行PCR反應(yīng)。

　　3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶

　　RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

　　*GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會導致在擴增目的產(chǎn)物時得到無關(guān)產(chǎn)物。

　　*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結(jié)合會導致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。

　　*RNA降解。

　　*PCR管或試劑污染。

　　注意：雜帶一般是因為沒有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。

　　4. 得不到全長的5’RACE PCR產(chǎn)物

　　*CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。

　　*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量。

　　*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

　　三、PCR

　　在進行PCR時：

　　*請確保您沒有使用過量的起始DNA或者過高濃度的引物，也沒有加入過量的Mg++

　　*請確保您使用了恰當?shù)耐嘶饻囟?

　　*請確保您沒有使用過量的DNA聚合酶

　　四、引物

　　1. 應(yīng)該選擇哪種純化方法?

　　取決于實驗?zāi)康暮鸵�物的長度

　　2. 為什么我訂購了50nmol，但是收到卻只有40nmol?

　　50nmol是起始量

　　3. 怎樣制備100μM的儲液?

　　體積(μl)=質(zhì)檢報告上的nmol數(shù)目×10

　　4. 怎樣設(shè)計引物?

　　*一般長度20-30bp;

　　*至少50%的GC含量;

　　*避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu);

　　*引物對的Tm值應(yīng)該接近。

　　5. 引物序列有插入或缺失?

　　*使用上游和下游引物多測幾個克隆。

　　*請選擇正確的純化方法。

　　6. PCR無結(jié)果?

　　*請檢查引物設(shè)計是否正確;

　　*請檢測OD讀數(shù)是否正確;

　　*做一個陽性對照和一個陰性對照