1引言

　　用離子色譜法適合于分析無機、有機陰離子。梯度淋洗是快速、靈敏分析強保留離子和弱保留離子混合物的有效方法。但梯度淋洗的條件的摸索卻相當費時，如果能創建計算機模擬程序，先根據樣品的組成，對要分析的樣品進行模擬分離，得出大致條件，再通過實驗進行適當校正，能大大提高工作效率。實現離子色譜線性梯度條件下分離陰離子的計算機模擬的關鍵是梯度條件下陰離子保留值的預測和離子色譜峰峰形的預測。Madden等[1]研究了用人工神經網絡(artificialneuralnetwork)對離子色譜線性梯度條件下分離陰離子的保留值的預測。該方法用一系列不同的梯度淋洗的實驗數據對神經網絡進行訓練，從而使此系統有預測智能。國外一些學者在經典離子交換色譜梯度淋洗分離蛋白質保留值的預測方面進行了很多工作[2～4]。國內尚未見在梯度條件下陰離子保留值的預測和離子色譜模擬分離方面工作的報道。人們在反相液相色譜梯度條件下組分保留值的預測方面也做了大量的工作[5～7]。

　　本實驗使用DionexAS18陰離子分離拄，用NaOH淋洗液，研究了在梯度淋洗過程中不同時間組分質點在離子色譜柱中的位置，及所在時間和位置的淋洗液濃度，得出所在時間和位置的容量因子，從而得出組分所在時間和位置的遷移速度，通過積分得出保留時間。再根據離子色譜峰峰形變化的規律，得到色譜峰峰形的有關參數，編程進行模擬分離，得到了保留時間與峰形與實驗非常接近的色譜圖。

　　2理論

　　2.1等度淋洗保留模型

　　梯度淋洗保留值的數學模型是建立在等度淋洗的數學模型基礎上的。使用NaOH作為淋洗液時，常用實驗節點模型(EEPM)[8]預測保留值，陰離子容量因子k和NaOH濃度關系如下：lgk=C1 C2lg[OH-](1)通過實驗數據可以求出待定系數C1和C2。

　　還有一個模型稱為DryLab模型[9]，此模型在EEPM基礎上加了一個二次項校正：lgk=C1 C2lg[OH-]+C3(lg[OH])2(2)Madden等[9]的研究證明，用DryLab模型對一些極弱有機酸陰離子和磷酸根等離子的誤差更小。

　　由于EEPM模型預測較簡單又較準確，對于大多數陰離子，則采用EEPM模型預測;對于磷酸根、砷酸根等陰離子，則采用DryLab模型。

　　2.2梯度淋洗的保留值的數學模型

　　2.2.1初始等度運行階段梯度程序開始有時有一段等度運行時間t0，此時整個色譜柱，淋洗液的濃度均為初始濃度。如果用EEPM模型，此時組分質點的遷移速度為：v=v0k0 1=v0exp(C1 C2lg[OH-]0)+1(3)其中v為組分質點的遷移速度，v0為淋洗液質點的遷移速度，[OH-]0為淋洗液的初始濃度。

　　2.2.2淋洗液的濃度開始增加到停止增加階段等度運行時間t0過后，淋洗液濃度開始升高。對于低壓梯度色譜系統，淋洗液濃度的升高是從比例閥開始的，經過壓力傳感器、泵頭、梯度混合器及管路到進樣環、到色譜柱頭，需要一段時間，這段時間稱之為儀器滯后時間[5,6]。該滯后時間對等度淋洗不會產生絲毫影響，但使得梯度淋洗液的濃度變化延時。初始時間后到初始時間加儀器滯后時間范圍內，雖然比例閥處淋洗液濃度已在升高，但整個色譜柱內，淋洗液的濃度仍為初始濃度，此時組分質點的遷移速度仍為(3)式。初始等度運行時間加儀器滯后時間，在色譜柱柱頭，淋洗液的濃度開始上升。但由于前一段時間的等度淋洗，組分質點已遷移了一段距離，在組分質點處，在濃度開始增加的淋洗液質點追上組分質點前，淋洗液的濃度仍為初始濃度，此時組分質點的遷移速度仍為(3)式。

　　再經過一段時間，濃度開始增加的淋洗液質點追上組分質點，從此時到淋洗液濃度停止增加，組分質點位置的淋洗液的濃度為：[OH-]=[OH-]0+(t-td-t0-t1)S(4)其中t為從進樣到此時的時間，td為儀器滯后時間，t0為初始等度運行時間，t1為淋洗液質點從柱頭到追上組分質點所需要的時間。s為單位時間淋洗液濃度的增加值。此時組分質點的遷移速度為：v=v0[]k0 1=v0exp{C1+C2lg[[OH-]0+(t-td-t0-t1)S]｝+1(5)2.2.3淋洗液的濃度上升停止階段淋洗液濃度停止增加后的開始階段，濃度停止增加的淋洗液質點還沒有追上組分質點。在組分質點位置處，淋洗液濃度還在繼續增加，組分質點位置的淋洗液的濃度仍然為(4)式，此時組分質點的遷移速度仍然為(5)式。

　　一段時間后，濃度停止增加的淋洗液質點追上組分質點，則組分質點位置的淋洗液的濃度為此階梯度的淋洗液最終濃度。此時組分質點的遷移速度為：v=v0k 1=v0C1 C2lg[OH-]f+1(6)[OH-]f為此階梯度的淋洗液最終濃度。則一階離子色譜線性梯度條件下組分離子保留時間為：tR=l1vi+∫l20dlv+l3vf=l1+l3v0/[exp(C1 C2lg[OH-]0)]+1+∫l20dlv0/[exp(C1 C2lg[OH-]0)](7)其中vi為初始等度淋洗階段組分離子的遷移速度，l1為在此遷移速度下組分的遷移的距離，l2為在梯度淋洗條件下組分變速遷移的距離，vf為淋洗液的濃度為最終濃度階段組分離子的遷移速度，l3為在此遷移速度下遷移的距離。需要注意的是，這里梯度淋洗階段和最終濃度階段，是針對組分所處的位置的淋洗液的濃度而言，滯后于梯度程序的梯度淋洗階段和最終濃度階段。

　　3實驗部分

　　3.1儀器和試劑

　　離子色譜儀系統，配有梯度泵、柱溫箱、脫氣裝置、電導檢測器、(2mm)電導抑制器、電腦配色譜工作站及BorlandDelphi7.0程序設計語言。實驗所用的甲酸、NaCl,NaNO3等試劑均為分析純試劑。

　　3.2色譜柱和流動相

　　以濃度為50%的NaOH溶液配制淋洗液。用去離子水將分析純試劑甲酸、氯化鈉，亞硝酸鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、磷酸鈉、碘化鉀、檸檬酸三鈉配制成濃度為200mg/L的儲備液，使用前將其稀釋成濃度為2~10mg/L的溶液。所用水為去離子水，其電阻率大于10MΩ?cm。

　　IonPacAG18陰離子保護柱(50mm×2mmi.d.)，IonPacAS18陰離子分離柱(250mm×2mmi.d.)。柱溫：30℃。以NaOH溶液作為淋洗液，由去離子水和NaOH溶液組二元梯度淋洗系統。A為去離子水;B濃度為100mmol/L的NaOH溶液。淋洗液流速：0.25mL/min。

　　3.3儀器滯后時間td和死時間tM的測定

　　將離子色譜保護柱柱頭的淋洗液管路斷開，開泵用100%的去離子水的沖洗。將壓力傳感器、泵頭、梯度混合器及管路到進樣環里面的NaOH沖洗干凈后(通過測流出液的pH值)，開始輸送NaOH溶液，流速為0.25mL/min。從這時起到進樣環流出液為堿性，這段時間即為儀器滯后時間td。在此色譜條件下，測得td=3.75min。以去離子水的負峰的出峰時間作為死時間，測得tM=2.95min。

　　4結果與討論

　　4.1不同陰離子容量因子的對數與淋洗液濃度的對數的關系

　　對于所研究的每一種陰離子，通過測得的7~10個不同淋洗液濃度條件下的保留時間，算出在不同淋洗液濃度條件下的容量因子。通過一元線性回歸(用EEPM模型)或二次多項式回歸(用DryLab模型)處理，得到不同陰離子容量因子的對數與淋洗液濃度的對數的關系的回歸方程(見表1)。將不同陰離子的回歸方程的C1、C2和C3存入數據庫，模擬時調用。對于絕大多數陰離子，用EEPM模型就能準確地描敘陰離子容量因子的對數與淋洗液濃度的對數的關系。但對于磷酸根這樣的末級電離常數非常小的陰離子，用DryLab模型較好[8]。

　　4.2計算機模擬程序

　　設計一Delphi程序，模擬用NaOH淋洗液梯度淋洗分離不同的陰離子。程序運行后，選擇梯度淋洗的色譜條件，選擇模擬分離的陰離子及濃度。模擬進樣后，程序根據選擇的數據，從數據庫中調出不同的陰離子的容量因子隨淋洗液濃度變化關系數據，運用前面所述的數學模型，算出各時刻陰離子質點所在位置的淋洗液濃度、對應的容量因子、遷移速度、保留時間。色譜圖用修改的高斯曲線模型EMG曲線模型[9，10]模擬。通過實驗、數據處理后得到不同的陰離子在等度淋洗及梯度淋洗條件下的EMG參數隨保留值變化的速率，存入數據庫，模擬時調用。梯度淋洗時EMG參數σ、τ隨保留值增加的速率較慢，從而模擬得到較窄的色譜峰。基線漂移的模擬是根據實際每分鐘漂移的信號的大小，將漂移值疊加到修改的高斯曲線中。基線的噪音通過將隨機函數值疊加到修改的高斯曲線進行模擬。

　　4.3模擬結果及討論

　　圖1A和圖1B分別為2種不同的梯度程序淋洗甲酸根、Cl、NO-2、SO2-4、NO-3、PO3-4、檸檬酸根和I-的色譜圖和模擬色譜圖。表2為這些陰離子在這2種梯度淋洗條件下保留值的預測值誤差的統計數據。梯度淋洗程序1為比較平緩的線性梯度，條件為：開始時淋洗液濃度從32mmol/L線性上升，15min后升高到80mmol/L，保持5min后回到初始濃度。梯度淋洗程序2為比較陡峭的線性梯度，條件為：開始有4min的淋洗液濃度為28mmol/L的等度淋洗，4min后淋洗液濃度開始線性上升，上升1min后升高到100mmol/L，保持15min后回到初始濃度，此梯度接近于一臺階梯度。

　　圖1中甲酸根、Cl-和NO-2實際是等度淋洗出色譜柱的。因為儀器在此條件下有3.75min的滯后時間，濃度升高的淋洗液還沒有到達色譜柱頭，甲酸根已流出色譜柱。雖然Cl-和NO-2的保留時間大于儀器的滯后時間，但濃度升高的淋洗液到達色譜柱頭時，Cl-和NO-2已快流出色譜柱，濃度升高的淋洗液還未追上Cl-，Cl-和NO-2已流出色譜柱。同理，由于有4min的等度淋洗，圖1B中除了甲酸根、Cl-、NO-2外，SO2-4也是等度淋洗出色譜柱的。

　　A.程序1――平緩線性梯度(gradientelutionprofile1:mildlineargradient);B.程序2――陡峭線性梯度(gradientelutionprofile2:steeplineargradient)。1.HCOO-;2.Cl-;3.NO-2;4.SO2-4;5.NO-3;6.PO3-4;7.檸檬酸根(citrate);8.I-。

　　從表2可以看出，此程序模擬離子色譜梯度淋洗陰離子，無論是比較平緩的線性梯度還是接近于臺階梯度的線性梯度，模擬色譜圖的保留時間是比較準確的，最大相對誤差小于5%。

　　離子色譜梯度淋洗陰離子色譜峰峰形的變化規律比較復雜。對于比較平緩的線性梯度(如圖1A)。變化規律比較簡單，基本上符合色譜峰的EMG參數σ(標準偏差)、τ(指數衰減時間常數)隨保留時間線性變化的規律[11]，圖1A(b)就是基于這種數學模型模擬的結果。與圖1A(a)進行比較，色譜峰峰形非常接近。對于臺階梯度和比較陡的線性梯度，色譜峰峰形的變化規律相當復雜，臺階梯度和比較陡的線性梯度的色譜圖一般有一個陡坡，一般來說，在靠近陡坡頂出峰的色譜峰，色譜峰比較窄。在有些情況下，色譜峰特別窄(如圖1B)，保留時間較長的檸檬酸根的色譜峰還大大窄于保留時間較短的SO24、NO-2的色譜峰。用此峰來計算色譜柱柱效，柱效離奇的高(色譜工作站顯示用檸檬酸根的色譜峰計算色譜柱柱效高達36401理論塔板數，其半蜂寬大大低于保留時間較短的SO2-4、NO-2、PO3-4的保留時間)。有關機理非常復雜，Enlund等[12]對色譜和毛細管電泳出現的柱效奇高的現象進行了探討。本研究模擬時，也考慮了這一點。圖1B(b)為在圖1B(a)條件下的模擬色譜圖，模擬色譜圖與真實色譜圖的峰形非常接近。