CSA法和改進CSA法的敏感性和存在的問題

　　提高IHC敏感性有幾種途徑。一是依靠各種IHC的前處理，例如酶的消化、高溫的抗原修復，雖然對其的基本原理不十分清楚，但卻十分實用;其次是增加IHC方法的放大倍數，主要是酶結合量的增加。例如EnVison法，一個EnVision葡聚糖多聚物結合100個左右的酶分子和15個抗體分子，要比二步法S-P(LSAB)上結合的酶分子多許多倍。

　　雖然EnVision法的敏感性大大提高，方法也簡便，但其大分子對于核內抗原的定位就不如LSAB法，存在穿透核膜困難的問題。因而，有時EnVision法就不如LSAB法敏感，尤其是活細胞核內抗原定位更為困難。CSA法的應用，既克服了LSAB法敏感性不高的缺點，又保留了較好的細胞穿透性。

　　已有的研究結果證實(Hasui K，2005;倪燦榮等，1999)，CSA法較LSAB法敏感500—1000倍，較EnVision法敏感20～100倍。其對細胞周期素等核內抗原的定位，有獨特的優點，定位準確性、敏感性、穩定性要較標準的CSA法好，其敏感性和穿透性要好于EnVision法。

　　最近，Hasui K等(2005)的研究結果表明，CSA法具有很高的敏感性的同時，也存在嚴重的內源性物質干擾(內源性生物素、內源性過氧化物酶、第一抗體與組織細胞內的不明物質的非特異性結合)，尤其是經抗原熱修復后情況更為嚴重。作者應用標準的EnVision法、CSA法和改進(加阻斷劑)的CSA法檢測淋巴結、正常肝、肝細胞癌、胃腸道鱗癌及癌周正常組織中k167抗原，其檢測最佳效果的標準流程如下。

　　(1)4um石蠟切片常規脫蠟至水，PBS洗3x3min。

　　(2)首先用0.3%過氧化氫甲醇破壞內源性過氧化物酶的活性，室溫20min。

　　(3)PBS洗3x3min。

　　(4)抗原修復，室溫冷卻20min。

　　(5)PBS洗3x3min。

　　(6)第二次用0.3%過氧化氫PBS破壞內源性過氧化物酶的活性，室溫5min。

　　(7)用溫的(35℃)TBST[0.02mol/L(pH7.8)Tris—HCl+NaCl+0.1%Tween20]洗3x3min。

　　(8)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白)，以阻斷第一抗體的非特異性結合位點，10min，不洗。

　　(9)滴加適當稀釋的第一抗體(在S-P法基礎上5—10倍稀釋)，或4℃過夜。

　　(10)PBS洗3x3min，溫的(35℃)TBST洗3x3min。37~C孵育15～60min，

　　(11)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白)，以阻斷多聚物試劑的非特異性結合位點，lOmin，不洗。

　　(12)多聚物(EnVision)孵育15min，溫熱(35℃)TBST洗3x3min。

　　(13)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白)，以阻斷CSA試劑的非特異性結合位點，10min，不洗;如用熒光素標記酪胺需用TBST洗3次。

　　(14)用生物素標記酪胺孵育15rain;如用熒光素標記酪胺孵育15～30rain。溫熱(35~C)TBST洗3X3min。

　　(15)鏈霉親和素—HRP 37~C孵育15rain或HRP標記的抗FITC抗體孵育30rain，溫的(35℃)TBST洗3X3min。

　　(16)0.04%DAB(含0.03%Hz02)顯色5～10min。

　　(17)復染、脫水、常規樹膠封固和結果觀察。