在免疫組化過程中，為了更好的說明問題和查找原因，最好設(shè)置陽性對照片(已知的高表達(dá)相應(yīng)抗原的組織)和陰性對照組織片(不加一抗但是加二抗系統(tǒng)/不加任何抗體兩組)，所有操作過程應(yīng)完全一致。

　　染色弱或者沒有染色(按照先后順序，先排除一些簡單的原因)：

　　試劑使用順序錯誤或者漏加試劑重復(fù)實驗，保證每一步均正確

　　二抗和一抗不匹配選擇匹配的二抗

　　底物和酶不匹配選用匹配的底物

　　酶失活換用新的酶(將酶和底物混合，看是否顯色?)

　　組織中沒有待測抗原表達(dá)或者表達(dá)水平低使用陽性對照片

　　抗體濃度太低增加抗體濃度.最好使用不同濃度的抗體，決定最佳濃度

　　抗體孵育時間不充分延長抗體孵育時間

　　底物孵育不充分延長底物孵育時間

　　抗體儲存不當(dāng)，導(dǎo)致失效將抗體分裝，低溫保存 (-20 to -70 C) ，避免反復(fù)凍溶。稀釋抗體在4保存1-2周，避免時間過長�；蛘吒鶕�(jù)說明書進(jìn)行恰當(dāng)?shù)谋４?

　　一抗失效換用新的一抗

　　二抗失效換用新的抗體(能否成功與其它一抗配合?)

　　脫石臘不充分延長脫臘時間或者換用新的二甲苯

　　組織固定不充分或者不當(dāng)增加固定時間或者改用不同的固定方法

　　組織固定過度減少固定時間。若已固定過度，則需使用正確的或者推薦的抗原修復(fù)方法

　　復(fù)染試劑與底物系統(tǒng)不匹配選擇正確的復(fù)染試劑(不加復(fù)染劑，看是否有組織染色?)

　　封片劑不正確選擇正確的封片劑

　　染色背景高：

　　可能原因解決辦法

　　洗片不充分每步之間至少洗片3次

　　組織含有內(nèi)源性的酶，如HRP/AP在加入一抗之前使用3%的H2O2甲醇封閉內(nèi)源性HRP活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻斷內(nèi)源性AP活性。或者換用葡萄糖氧化酶系統(tǒng)

　　組織含有內(nèi)源性生物素(尤其是腎臟、肝和脾)在加入一抗之前，血清封閉之后使用avidin/biotin阻斷試劑�；蛘弑苊馐褂胋iotin-avidin系統(tǒng)或改用IF方法(直接將酶和底物加到組織片上，看是否顯色?)

　　一抗的非特異性結(jié)合或者抗體濃度過高增加一抗的稀釋度

　　二抗和組織非特異性結(jié)合使用與二抗來源相同的正常動物血清(一般是10%)封閉，必要時可以將血清濃度加大

　　組織固定不充分，抗原擴散Increase duration of postfixation

　　使用小鼠來源的二抗檢測小鼠組織在加一抗之前使用MouseOnMouse封閉試劑

　　干片染色過程中避免出現(xiàn)干片現(xiàn)象

　　染色強度過大：

　　可能原因 解決辦法

　　一抗或者二抗?jié)舛冗^高降低抗體濃度�；蛘呤褂貌煌�的濃度，決定最佳染色濃度

　　孵育時間過長減少孵育時間

　　孵育溫度太高降低孵育溫度，在4℃過夜或者37℃0.5-1小時或者RT

　　底物孵育時間過長減少孵育時間

　　干片染色過程中避免出現(xiàn)干片現(xiàn)象