單核細胞分離原理、方法及要點:

　　基本原理：本文分離單核細胞所用方法是Percoll非連續性密度梯度離心法，主要是根據不同細胞間密度的差別進行細胞分離。此法易操作，且使用通常的實驗設備即可完成。

　　試劑與器材

　　1)外周血單個核細胞

　　2)1×PBS和10×PBS(無Ca2+、Mg2+，0.5mM EDTA)，胎牛血清(56℃，30分鐘加熱滅活)，HCl1mol/L。

　　Percoll分層液(密度=1.130g/ml,商品)，4g/L臺盼藍染液(溶解在PBS液中)。

　　3)50ml聚丙烯圓錐管，毛細吸管，移液管(1、2、10ml)。

　　4)CO2孵箱，超凈臺，有旋轉桶轉子裝置的離心機，PH計。

　　操作步驟——所有的操作應該在無菌條件下進行

　　(一)不同密度Percoll分層液的配制

　　1.Percoll分層液儲備液的制備：取未稀釋的Percoll原液(從瓶中取)9ml+1ml 10×PBS(無Ca2+、Mg2+)，用HCl 調節PH至7.4

　　2. Percoll分層液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制：取Percoll儲備液3.12 ml(前一步配制)+1.88ml 1× PBS1(無Ca2+、Mg2+)

　　3. Percoll分層液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制：取Percoll分層液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml1×PBS( 無Ca2+、Mg2+)

　　4. Percoll分層液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制：取Percoll分層液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml1×PBS(無Ca2+、Mg2+)

　　(二)不連續密度梯度制備

　　1.將洗滌過的8×107外周血單個核細胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在這層液體的表面上輕輕鋪上2mlPercoll分層液(Ⅱ)(密=1.069g/ml)，后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)

　　2. 20℃，在旋轉轉子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘(慢慢增加速度，無制動停轉)。

　　(三)單核細胞的分離

　　1. 離心后單核細胞存在于Percoll分層液(Ⅱ)和(Ⅲ)(密度較小的部分)之間的界面中。

　　2. 用毛細吸管仔細收集單核細胞。

　　3. 用含1-5%胎牛血清的 1×PBS液洗滌細胞3次，4℃，400×g離心5分鐘，棄上清液。

　　4. 若需要進一步實驗，將細胞重新懸浮于培養基中。

　　5. 用臺盼藍拒染法測定細胞存活率。

　　結果：本法回收的細胞中單核細胞占70-100%(存活率應大于90%)，淋巴細胞占0-20%，粒細胞占0-5%，紅細胞占0-7%，血小板小于0.5%。

　　實驗要點

　　1.為了得到較好的結果，外周血單個核細胞分離后應立即使用。

　　2.所有操作過程應在18-20℃中進行。

　　3.仔細覆蓋各種Percoll分層液，避免破壞其界面。

　　4.洗滌分離細胞3次，以除去殘存的Percoll分層液和血小板。

　　5.如果所制備的細胞仍不純，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗體分子的磁珠，以除去殘存的NK、T、B淋巴細胞。