hoechest33342和hoechst33258兩種(主要為凋亡活細(xì)胞)在紫外光下將核染為藍(lán)色。Hoechst染細(xì)胞核會(huì)影響共聚焦顯微鏡對(duì)該樣本其他熒光的觀察效果。hoechsthoechsts33258，hoechst33342二者區(qū)別不大，但是hoechst33342對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些，所以一般來(lái)說(shuō)hoechsts33258用于細(xì)胞固定后再染色，而hoechst33342則可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色!

　　染色步驟

　　PI(PropidiumIodide碘化丙啶)染色：是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色(PropidiumIodide，PI)是一種核酸染料(紅試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。碘化丙啶色)，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。

　　用PI單一染色觀測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，只能表示細(xì)胞的壞死情況，而不是凋亡(當(dāng)然晚期凋亡PI亦可著色)。但是如果您只是想知道細(xì)胞的死亡情況，而不是仔細(xì)區(qū)分壞死或凋亡，那么PI單一染色也可以。但是如果您一定要認(rèn)定細(xì)胞的凋亡，那么PI單一染色顯然不夠!

　　annexin-v染色細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜標(biāo)志發(fā)生改變。其中，磷脂酰絲氨酸(Annexin-V，PS)外翻，Annexin-V在Ca2+存在的條件下與其高親和力特異性結(jié)合。這樣，Annexin-v染色陽(yáng)性，表示細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài)。Annexin-V結(jié)合不同的熒光抗體，就可以利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。AnnexinV用FITC標(biāo)記發(fā)綠色熒光;如果用PE標(biāo)記就發(fā)紅色熒光。

　　JC-1染色JC-1是一種陽(yáng)離子染料，可以在線粒體內(nèi)聚集，低濃度時(shí)主要以單體(monomer)存在，發(fā)射光以綠光(～525nm)為主;而在高濃度時(shí)則可以形成多聚體(aggregation)，發(fā)射光以紅光(-590nm)為主。線粒體本身存在一定的極性(polarization)，其外膜為負(fù)極，內(nèi)膜為正極。電位差由Ca2+、Na+和H+流調(diào)控。當(dāng)線粒體狀態(tài)良好時(shí)對(duì)JC-l攝取量少，因而在線粒體內(nèi)主要以單體的形式存在綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度的比值較高。

　　在線粒體發(fā)生去極化(depolarization)時(shí)，線粒內(nèi)JC-l的濃度較高，多以多聚體的形式存在，綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度的比值降低。JC-1染色的綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度僅取決于線粒體的膜電勢(shì)(membranepotential)，而與線粒體的形態(tài)、體積和密度都無(wú)關(guān)，因而能更好地反映線粒體的功能狀態(tài)。由于凋亡發(fā)生的早期存在線粒體的去極性，因此，JC-1染色被用于檢測(cè)凋亡的早期發(fā)生。其實(shí)驗(yàn)方法如下。

　　JC-l染色非常簡(jiǎn)單。首先可將成品JC-1以DMSO配成儲(chǔ)存液(1~5 mg/ml)，儲(chǔ)存于-20℃，用時(shí)以培養(yǎng)液稀釋至10 ug/ml 終濃度。對(duì)貼壁細(xì)胞可以直接棄去培養(yǎng)液，漂洗細(xì)胞后直接加入染色液，10~30 min后在熒光顯微鏡下或者激光共聚焦下觀察。線粒體狀態(tài)好時(shí)細(xì)胞以綠色為主，當(dāng)紅光信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，紅綠相疊，以橙色為主。該染色運(yùn)用于懸浮細(xì)胞時(shí)還可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，收集紅/綠信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算其強(qiáng)度比。

　　鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)：Calcein-AM本身并不是熒光分子，但通過(guò)活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，Calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光(激發(fā)：490 nm，發(fā)射：515 nm)。因此Calcein-AM僅對(duì)活細(xì)胞染色。