(1)E.coli TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞的制備

　　取10ul TOP10F’菌液，接種于200ml LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，37℃，200 rpm，16～18小時(shí)。取100ul菌液接種于200ml液體LB培養(yǎng)基中。

　　37℃，200 rpm，培養(yǎng)16～18小時(shí)。

　　滅菌500 ml離心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10%甘油重懸并洗滌。重復(fù)洗滌3次。

　　第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約1ml 液體用于重懸菌體。

　　從制得得感受態(tài)細(xì)胞中，取200ul于滅菌EP管中，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物5ul，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置5min。

　　將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。

　　使用電擊穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化，設(shè)置為電壓 2500 V，時(shí)間 5 ms。

　　電擊后，往電擊杯中加入 800ul SOC培養(yǎng)基，沖洗出菌體，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，輕搖45～60 min。

　　取全部均勻涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB-Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流動(dòng)，37℃ 培養(yǎng)12～16小時(shí)。

　　(2)線性化質(zhì)粒DNA對(duì)Pichia pastorisGS115的轉(zhuǎn)化

　　取新鮮制備的(或-70℃凍存的)感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，使其完全解凍;

　　1)將100μl菌體移出至一新的無(wú)菌Eppendorf管中，加入5-20μg線性化質(zhì)粒(5～10μl)，輕彈混勻，盡數(shù)吸出轉(zhuǎn)移到0.2cm型的電穿孔轉(zhuǎn)化杯中;

　　2) 轉(zhuǎn)化杯置于冰浴中5～10分鐘，保持低溫。

　　3) 電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件：電壓：1500V;電阻：400Ω;電容：25μF;脈沖時(shí)間：10mS;一次電擊。

　　4) 電擊后，馬上在電擊轉(zhuǎn)化杯中加入1ml 4℃預(yù)冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻，置于冰浴中;

　　5) 取30℃烘至表面半干的MD培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作涂布平板，400μl/板