DNA片斷的回收

　　方法一：樹脂回收技術

　　本方法特別適合于PCR片段的回收，具有純度高、操作簡潔等特點，經(jīng)此方法回收的片段可有效的用于重組載體構建。通過15分鐘的純化過程,PCR產(chǎn)物即能被有效地從含引物二聚體、非特異性擴增引物片斷等混合物中分離出來，成為高度無鹽的、不含其他大分子成分的純化片斷。在較寬的分子量范圍內(nèi)有較高的回收效率。下表為不同長度的DNA片斷,在室溫條件下,用此純化系統(tǒng)直接純化時,各自相應的回收率。

　　dsDNA長度bp 200 1500 300 200 75 50

　　回收率% ≥ 60 96 99 69 3 2

　　一：儀器 離心機電泳議電泳槽取液器微量真空裝置抽濾裝置

　　二：PCR片斷純化試劑盒80%異丙醇

　　三：操作

　　(一)從瓊脂糖介質(zhì)中純化DNA片斷

　　1:用低熔點或常規(guī)熔點瓊脂糖電泳對PCR擴增片斷進行分離,該電泳安常規(guī)方法進行,緩沖液為TAE.

　　2:在凝膠上,找到所需條帶,然后用潔凈并滅菌的小刀將其切下接近300微升瓊脂糖凝膠 (約300毫克)

　　3:如果切下的瓊脂糖為高融點的則安下面A步驟進行,如為低融點瓊脂,則安B步驟進行。

　　A：將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中,加入1毫升純化用樹脂,然后將其置于65℃水浴保溫5分鐘,或保溫至瓊脂完全溶解。

　　B： 將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中,然后將其置于70℃水浴保溫至瓊脂完全溶解,然后加入1毫升純化用樹脂到融化好的瓊脂中,將其混合20秒,但不要振動。

　　4:為每一個待回收片斷準備好一個微量柱. 在每個柱的開口處,聯(lián)上一針筒,然后將這些柱與針筒的復合體與抽真空設備相連

　　5:在柱-針筒復合體中加入樹脂/DNA混合物,打開真空裝置,將樹脂與DNA的混合物抽到 微量柱中,斷開真空裝置與柱的連接。

　　6:洗柱,加入2毫升80%的異丙醇,打開真空裝置,使這些洗柱液完全流經(jīng)微量柱。

　　7:繼續(xù)真空30秒以干燥樹脂,注意此干燥時間不能超過30秒。關閉真空,移去針筒。將微量柱轉(zhuǎn)移至一1.5毫升微量離心管中。10000g離心2分鐘,以徹底除去殘存的異丙醇。

　　8: 將微量柱,再轉(zhuǎn)移至一新的1.5毫升微量離心管中,加入50微升水或TE緩沖液,靜置1分鐘(在頭30秒,DNA仍將吸附于柱上), 10000g離心20秒,以洗脫DNA片斷，所得純化后的DNA片斷可直接用于連接反應或在-20℃保存。

　　注：1對于>3Kb的片斷在純化回收時,洗脫前,如先將水或TE緩沖液預熱到65-80℃,則將能有效的提高回收率。待洗脫片斷>3Kb時,洗脫液溫度應為65-80℃;待洗脫片斷>20Kb時,洗脫液溫度應達80℃。

　　2應用TAE緩沖液，而不應用含TBE的膠，因硼酸能與瓊脂糖中的方式糖單體或多聚體結(jié)合成難溶復合物，這種復合物使膠難熔解。

　　3：在取用純化柱樹脂中的液體前,應將樹脂充分攪勻,如樹脂中出現(xiàn)結(jié)晶或結(jié)塊,則應將樹脂在25-37℃,溫熱10分鐘,冷卻至30℃使用。樹脂本身不會溶。

　　4：在紫外光下觀察切割條帶時,操作要快，DNA條帶在紫外光下的暴露時間應盡量短，因UV會引起DNA變異。