葡萄糖氧化酶法

　　1.原理

　　葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下使鄰聯(lián)甲苯胺生成藍(lán)色物質(zhì)，此有色物質(zhì)在625nm 波長下與葡萄糖濃度成正比。通過測定藍(lán)色物質(zhì)的吸光度可計(jì)算樣品中葡萄糖的含量。

　　2.適用范圍

　　適用于谷類、乳類、飲料、酒類等食物樣品和血液樣品。檢出量為0.02 mg。

　　3.儀器

　　722分光光度計(jì)。

　　4.試劑：

　　除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，試劑為分析純。

　　(1) 乙醇。

　　(2) 40% 三氯乙酸：稱取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀釋至100ml。

　　(3) 2 mol/L NaOH 溶液：稱取8g NaOH， 用水溶解并稀釋至100ml。

　　(4) 1 % 鄰聯(lián)甲苯胺溶液：稱取0.1 g 鄰聯(lián)甲苯胺溶解于10 ml無水乙醇中，倒入棕色瓶中，4 ℃ 冰箱保存。

　　(5) 乙酸緩沖液 (pH 5.0)：稱取14.28 g 乙酸鈉 (CH3COONa?"3H2O)溶于水中，加入2.7 ml 冰乙酸，并調(diào)節(jié)pH 5.0， 用水定容至1 L。

　　(6) 葡萄糖氧化酶溶液：稱取一定量的葡萄糖氧化酶(Sigma 公司)用水溶解，使酶含量為100 U/ml。4 ℃ 冰箱保存一周。

　　(7) 過氧化物酶溶液： 0.010 g 辣根過氧化物酶溶于10 ml 水中，4 ℃ 冰箱保存一周。

　　(8) 酶溶液：取100 ml 乙酸緩沖液，分別加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、過氧化物酶溶液各1 ml，混勻。4℃ 冰箱可保存七周。

　　(9) 酶空白液：取100 ml 乙酸緩沖液，分別加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液、過氧化物酶溶液各1 ml，混勻。4℃ 冰箱保存一周。(注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶)

　　(10) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99%)于80 ℃干燥至恒量。精確稱取0.050 g，用水移入100 ml 容量瓶中，定容至刻度線。相當(dāng)于濃度為0.5 mg/ml。

　　5.操作步驟：

　　5.1樣品處理：

　　(1)固體樣品：稱取0.5～5g已粉碎的樣品于錐形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷卻后，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反復(fù)搖動(dòng)混勻樣品，過濾，棄初始幾滴濾液。收集濾液。如果濾液澄清，可直接或經(jīng)進(jìn)一步稀釋后用于測定。如果濾液渾濁，吸取20ml濾液轉(zhuǎn)移至另一容量瓶中，加入無水乙醇至刻度。混合后靜置至少30min。過濾，濾液用于測定。

　　(2) 液體樣品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml樣品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。靜置至少30min，過濾后濾液備用。(如果過濾后濾液仍渾濁，或樣液體積過少，可3000rpm離心15 min，上清液備用。)

　　(3) 新鮮牛乳等樣品：吸取0.5～2ml 樣品，用水稀釋，加入3ml 40% 三氯乙酸溶液。用水定容至100ml，過濾。吸取5ml 濾液，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至中性，用水定容至10ml，備用。

　　(注：樣品處理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白質(zhì)，40% 三氯乙酸用于沉淀蛋白。)

　　5.2測定：標(biāo)準(zhǔn)管和樣品測定管，按下表所列操作(單位：ml)

　　試 劑標(biāo)準(zhǔn)空白管葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)管樣品空白管樣品測定管

　　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液——0.1～0.5————

　　樣品提取液————0.50.5

　　水0.5補(bǔ)至0.5————

　　酶溶液55——5

　　酶空白液————5——

　　上述試劑混合后37℃ 水浴反應(yīng) 15 min， 625 nm 測定吸光度值。

　　(注意：葡萄糖與酶溶液的成色反應(yīng)與反應(yīng)時(shí)間密切相關(guān)，如反應(yīng)時(shí)間過長，溶液顏色會(huì)由藍(lán)轉(zhuǎn)變成灰色，并慢慢產(chǎn)生沉淀，所以反應(yīng)時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制好。)

　　6.計(jì)算

　　根據(jù)吸光度值求出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，采用插入法求出樣品測定管中葡萄糖含量，再根據(jù)稀釋定容體積和稱樣量，計(jì)算出樣品中葡萄糖含量。

　　計(jì)算公式：

　　X= (As-Ab)×V×F×0.1

　　0.5×m

　　式中:

　　X——樣品中葡萄糖含量，g/100g;

　　As—— 由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求出的樣品測定管中葡萄糖含量，mg;

　　Ab——由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求出的樣品空白管中葡萄糖含量，mg;

　　V——樣品定容體積，ml;

　　F——稀釋倍數(shù)

　　0.5——測定時(shí)吸取樣品提取液的體積，ml;

　　m——樣品質(zhì)量，g;

　　0.1——將mg/g轉(zhuǎn)換成g/100g的系數(shù)。

　　7.注意事項(xiàng)

　　(1) 此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反應(yīng)，特異性強(qiáng)，靈敏度高。

　　(2) 如果樣品提取液為無色，無需做樣品空白。但是有些樣品顏色很深，如飲料、菌藻類食物，或樣品提取液渾濁，往往干擾測定結(jié)果但又難以去除，所以測定這類樣品時(shí)需做樣品空白管以減少干擾。