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質粒DNA的分離、純化
[2013/12/27]
所有分離質粒DNA的方法都包括三個基本步驟:培養細菌使質粒擴增;收集和裂解細菌;分離和純化質粒DNA。
1、堿裂解法原理:本實驗采用 堿裂解法 進行質粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉( SDS SDS)是一種陰離子表面活性劑,它既能使細菌細胞裂解,又能使一些蛋白質變性。
用SDS 處理細菌后,會導致細菌細胞破裂,釋放出質粒DNA 和染色體 DNA 。兩種 DNA 在強堿環境都會變性。
當加入 pH4.8 的酸性乙酸鉀降低溶液 pH 值后,質粒 DNA 將迅速復性,而染色體 DNA 分子巨大,難以復性。
通過離心,大部分細胞碎片、染色體 DNA 、RNA 及蛋白質沉淀( SDS 的作用下 )除去,而質粒 DNA 留在上清中 。
再用異丙醇沉淀、乙醇洗滌,可得到純化的質粒 DNA 。
2、實驗材料、主要儀器和試劑
(1)材料:含有質粒PBLG的大腸桿菌DH5α
(2)儀器:塑料離心管架(30孔);10、100、1000μL微量加樣器;1.5mL塑料離心管(又稱EPPendorf離心管);低溫高速離心機(20 000 r/min)一臺;無菌工作臺;高壓鍋;常用玻璃儀器及滴管等。
(3)試劑:LB培養基成分如下:每升含有胰蛋白陳10g,酵母提取物5g,NaCI10g,瓊脂糖或瓊脂(固體培養基時用)15g,用NaOH調pH至7.0;pH8.0 GET緩沖液(50mmol葡萄糖,10mmol/L EDTA,25 mmol/L Tris-HCl);0.2mol/L NaOH(內含1%的SDS),注:臨用時配;pH4.8乙酸鉀溶液(60mL 5mol/L KAc,11.5mL冰醋酸,28.5mL H2O):該溶液鉀離子濃度為3mol/L,醋酸根離子濃度為5mol/L;異丙醇;70%乙醇;pH8.0 TE緩沖液:10 mmol/LTris-HCI,lmmol/L EDTA,其中含RNA酶20ug/mL。
3、操作步驟
1)培養細菌將大腸桿菌PBLG接種在LB固體培養基上,37℃培養12h,挑一個菌斑接種在液體LB培養基上,37℃培養12~16h。
2)從菌落中快速提取制備質粒DNA
(1)在無菌工作臺上取1.5mL菌液加入EPPendorf離心管中,轉速10000r/min,離心lmin,去掉上清液(注意,一定要吸干上清液)。加入150μlGET緩沖液,充分混勻,在室溫下放置10min。
注:溶菌酶在堿性條件下不穩定,必須在使用時新配制溶液。使用EDTA是為了去除細胞壁上的Ca2+,使溶菌酶更易與細胞壁接觸。
(2)加入200μl新配制的0.2mol/LNaOH(內含1%SDS)。加蓋,顛倒2~3次,使之混勻,冰上放置5min。
注:SDS能使細胞膜裂解,并使蛋白質變性。
(3)加入150μl冰冷的乙酸鉀溶液(pH4.8)。加蓋后顛倒數次使混勻,冰上放置3-5min。
(4)用低溫高速離心機,轉速為10000r/min,離心5min,上清液倒入另一干凈的離心管中。
注:乙酸鉀能沉淀SDS和SDS與蛋白質的復合物,在冰上放置5min是為了沉淀完全。如果上清液經離心后仍混濁,應混勻后再冷卻至0℃重新離心。
(5)另取一個Eppendorf管,轉入上清,并加等體積異丙醇,混勻,室溫放置5min,12000r/min離心5min,棄去上清液。
(6)加入200μl無菌蒸餾水溶解沉淀,再加入1/2體積7.5mol/L NH4Ac,混勻后冰浴3~5min,以12000r/min離心5min。
(7)轉移上清至新管中,并加入等體積異丙醇或2倍體積無水乙醇,室溫放置5min后以12000r/min離心30min。棄去上清。
(8)沉淀用70%乙醇洗滌一次,小管倒置于吸水紙上,除盡乙醇,室溫自然干燥。
(9)加入20μlTE,使DNA充分溶解,置-20℃貯存,待用。
1、堿裂解法原理:本實驗采用 堿裂解法 進行質粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉( SDS SDS)是一種陰離子表面活性劑,它既能使細菌細胞裂解,又能使一些蛋白質變性。
用SDS 處理細菌后,會導致細菌細胞破裂,釋放出質粒DNA 和染色體 DNA 。兩種 DNA 在強堿環境都會變性。
當加入 pH4.8 的酸性乙酸鉀降低溶液 pH 值后,質粒 DNA 將迅速復性,而染色體 DNA 分子巨大,難以復性。
通過離心,大部分細胞碎片、染色體 DNA 、RNA 及蛋白質沉淀( SDS 的作用下 )除去,而質粒 DNA 留在上清中 。
再用異丙醇沉淀、乙醇洗滌,可得到純化的質粒 DNA 。
2、實驗材料、主要儀器和試劑
(1)材料:含有質粒PBLG的大腸桿菌DH5α
(2)儀器:塑料離心管架(30孔);10、100、1000μL微量加樣器;1.5mL塑料離心管(又稱EPPendorf離心管);低溫高速離心機(20 000 r/min)一臺;無菌工作臺;高壓鍋;常用玻璃儀器及滴管等。
(3)試劑:LB培養基成分如下:每升含有胰蛋白陳10g,酵母提取物5g,NaCI10g,瓊脂糖或瓊脂(固體培養基時用)15g,用NaOH調pH至7.0;pH8.0 GET緩沖液(50mmol葡萄糖,10mmol/L EDTA,25 mmol/L Tris-HCl);0.2mol/L NaOH(內含1%的SDS),注:臨用時配;pH4.8乙酸鉀溶液(60mL 5mol/L KAc,11.5mL冰醋酸,28.5mL H2O):該溶液鉀離子濃度為3mol/L,醋酸根離子濃度為5mol/L;異丙醇;70%乙醇;pH8.0 TE緩沖液:10 mmol/LTris-HCI,lmmol/L EDTA,其中含RNA酶20ug/mL。
3、操作步驟
1)培養細菌將大腸桿菌PBLG接種在LB固體培養基上,37℃培養12h,挑一個菌斑接種在液體LB培養基上,37℃培養12~16h。
2)從菌落中快速提取制備質粒DNA
(1)在無菌工作臺上取1.5mL菌液加入EPPendorf離心管中,轉速10000r/min,離心lmin,去掉上清液(注意,一定要吸干上清液)。加入150μlGET緩沖液,充分混勻,在室溫下放置10min。
注:溶菌酶在堿性條件下不穩定,必須在使用時新配制溶液。使用EDTA是為了去除細胞壁上的Ca2+,使溶菌酶更易與細胞壁接觸。
(2)加入200μl新配制的0.2mol/LNaOH(內含1%SDS)。加蓋,顛倒2~3次,使之混勻,冰上放置5min。
注:SDS能使細胞膜裂解,并使蛋白質變性。
(3)加入150μl冰冷的乙酸鉀溶液(pH4.8)。加蓋后顛倒數次使混勻,冰上放置3-5min。
(4)用低溫高速離心機,轉速為10000r/min,離心5min,上清液倒入另一干凈的離心管中。
注:乙酸鉀能沉淀SDS和SDS與蛋白質的復合物,在冰上放置5min是為了沉淀完全。如果上清液經離心后仍混濁,應混勻后再冷卻至0℃重新離心。
(5)另取一個Eppendorf管,轉入上清,并加等體積異丙醇,混勻,室溫放置5min,12000r/min離心5min,棄去上清液。
(6)加入200μl無菌蒸餾水溶解沉淀,再加入1/2體積7.5mol/L NH4Ac,混勻后冰浴3~5min,以12000r/min離心5min。
(7)轉移上清至新管中,并加入等體積異丙醇或2倍體積無水乙醇,室溫放置5min后以12000r/min離心30min。棄去上清。
(8)沉淀用70%乙醇洗滌一次,小管倒置于吸水紙上,除盡乙醇,室溫自然干燥。
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