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細菌中提取分泌蛋白質的方法

[2014/1/2]

  客戶需要從細菌中提取一種可分泌至培養基上清的一種小分子多肽,按照文獻的方法是取細菌上清后用氯仿抽提,可反復做過多次,蛋白總是沒有活性,不知道各位同仁有沒有什么好方法?請指教!

  以下參考意見:

  參考一:

  氯仿是有機溶劑,所以但沒有活性。分離這種分泌性蛋白質,可以先將上清液透析,然后過柱。

  參考二:

  蛋白要保持活性,必須維持三維構象,而在有機溶劑處理的情況下,蛋白的三維構象被破壞,自然就沒有活性了。

  如果你的培養液是高鹽濃度的,你可以在得到上清的可溶性蛋白后,加入5-10倍體積的復性液,以稀釋鹽濃度,防止在下一步透析過程中隨著鹽濃度的降低,造成蛋白析出沉淀而喪失活性,然后用透析袋進行透析,4度以防止蛋白降解,4-6小時,然后冷凍干燥,這樣得到的蛋白就能保持活性了。

  參考三:

  你的蛋白鏈內有二硫鍵么?結構一般不會太復雜吧?除非有復雜的二硫鍵,這么小的蛋白,復性應該不是主要矛盾。

  一些小蛋白如果在有機溶劑中發生的疏水結構的改變是可逆的,而且疏水性較強,那可能就可以用氯仿抽提,很容易和大部分蛋白分開,不過脂類和脂蛋白肯定去不掉。

  但是能溶于氯仿,你的蛋白我懷疑很有可能一般的水相條件并不是很好溶,先確定一下這個問題,然后結合你的測活方法,看看是不是在測活的時候蛋白失活的。

  參考四:

  我的蛋白確實是在一般的水相條件不好溶,活性的檢測方法沒什么問題,

  氯仿抽提后用6M的尿素溶解,加ddH2O 倍比稀釋后檢測活性! 這是文獻上的方法,可總是沒有活性。 不知道是不是氯仿抽提的方法有問題? 氯仿抽提法有沒有什么要注意的地方?

  參考五:

  培養上清中沒有尿素,可能蛋白濃度不高,但還是要確定一下蛋白能溶么?

  或是直接純化前取上清測活看看,到底是不是氯仿的問題。

  參考六:

  我所提的蛋白是不溶于水的,但是在6M、8M的尿素中是可容的

  取上清做證實上清是有活性的,所以我覺得是尿素沒有將我所需求的蛋白抽提出來,不知道是不是細節上出了些問題?各位,有沒有更好的辦法呢?

  參考七:

  是氯仿沒有把我所需的蛋白抽提出來

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