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蛋白質純化離子交換法

[2015/2/9]

  各種蛋白質分子上可能帶有?同的電性,經過離子交換管柱,可依其分子帶電性的差異而分離開? (Pharmacia 操作手冊, Ion Exchange)。

  儀器設備:

  塑料管柱 (Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm)

  分劃收集器 (fraction collector, 另需準備干凈試管約60 支)

  濃縮用離心機 (低速5,000 rpm) 及濃縮離心管Centriplus

  藥品試劑:

  DEAE Sephacel (膠體體積約15 mL,預先以緩沖液Buffer A-0 平衡好)

  Buffer A-0 (如上述配法)

  Buffer A-300 溶離液:Buffer A-0 加有0.3 M NaCl

  Buffer A-500 溶離液:Buffer A-0 加有0.5 M NaCl

  方法步驟:

  1) 將Econo-Pac 管柱架好,并將三向閥及軟管等組合完成。

  2) 震蕩DEAE Sephacel 膠體使的懸浮,小心倒入管柱中,讓膠體慢慢??,在??過程中隨時加入buffer A-0,勿使膠體干掉。

  3) 待膠體??完全后,高?應在15 cm 左右。膠柱以buffer A-0 一直?洗,?速快慢可以?考慮;連接好收集器,每試管收2.5 mL。離子交換法的膠體平衡極為重要,可測?出液的pH 或離子濃?,看是否與buffer A-0 相同,??一樣則需要再?洗的。

  4) 樣本的添加方法同上述膠體過濾法,并啟動分劃收集器開始收集,當樣本全部沒入膠體后,再加入同體積buffer A-0。以buffer A-0 ?洗50 mL 后,去除膠體上方的緩沖液,但勿使膠體干掉。

  5) 然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶離的,每批次?洗各50 mL,注意?換濃?時,膠體上方勿殘存上一種溶液。

  6) 收集所有分劃,進?蛋白質定?分析以及GUS 活性測定,結果作圖。

  7) 收集GUS 活性區,并以Centriprep-30 濃縮至 _______ mL (IEX),記得要保?100 μL。

  8) 離子交換膠體以buffer A-0 洗過50 mL 后,收起?交回。

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