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Southern轉印分析方法步驟
[2015/9/11]
在膠體中的DNA可利用毛細現象的作用將DNA牽引轉印至覆蓋在膠片上的濾膜,經烘烤或UV照射后,可使DNA固定在膜上,以進行探針的雜合(hybridization)反應。
儀器用具:
玻璃缸;玻璃板或吸水海綿;Crosslinker
藥品試劑:
10×SSC(1.5MNaCl;0.15Msodium citrate)或20×SSC
變性溶液(1.5M NaCl;0.5 NNaOH)
中和溶液(1MTris-Cl;1.5 M NaCl,pH7.5)
Nylon membrane尼龍膜
40 Methods in Biotechnology Vol 1
Whatman 3MM濾紙
吸水紙
方法步驟:
1)電泳的洋菜膠片,浸于0.25NHCl中15min(當DNA分子量不大時,可省去此步驟);以無菌水潤洗膠片后,將膠片置于變性溶液中,于室溫緩慢震蕩15min,更換新的變性溶液后再處理15min.
2)以無菌水潤洗膠片,再以中和溶液浸泡30min,其間更換一次。
3)戴手套將尼龍膜剪裁成膠體大小,在角落剪一缺口作記號。另裁剪數張較膠片稍小的3MM 濾紙。
4)取一玻璃缸,加入10×SSC。將一塊長形玻璃板架在缸上,裁剪一張長形3MM濾紙,寬度須略大于膠片,將濾紙置于玻璃板上,使濾紙兩端順著玻璃板垂入缸內溶液中。加一些10×SSC于濾紙上使其濕透,并趕掉濾紙與玻璃板間的氣泡。
若有3~5cm厚的干凈海綿,則可取代玻璃板。可將海綿置于缸中,加入10×SSC,但不可淹過海綿。海綿濕透后,其上放一張比膠片大的3MM濾紙,要趕掉濾紙與海綿間的氣泡。
5)將處理過的膠片置于濾紙上,趕掉氣泡,小心將尼龍膜蓋在膠片上,不要有氣泡產生。 再依序蓋上兩張以10×SSC浸濕的濾紙及兩張干的濾紙,并以保鮮膜將膠片四周封住。最后覆蓋一迭吸水紙,上面放一塊玻璃板或塑料板,以重物壓住即可。在室溫下靜置過個夜。
6)轉印后,小心移去重物、吸水紙、3MM 濾紙等,在尼龍膜相對于樣品槽的位置作記號。將尼龍膜掀開,與膠片接觸面朝上,置于10×SSC中緩慢震蕩5min,以洗去附著在膜上的洋菜膠。轉印后的膠片可再以EtBr染色,視是否轉印完全。
7)將尼龍膜置于干凈的濾紙上(與膠片接觸面朝上),移至UVcrosslinker中,進行crosslinking 以將DNA固定在膜上。
8)干燥后的尼龍膜即可進行雜合。若不立即進行雜合,可將尼龍膜夾于兩張濾紙間,置于干燥箱中存放。