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典型PCR操作程序與優化方法
[2015/9/14]
一、試劑
(1)引物根據待擴增DNA不同,引物亦不同。
(2)耐熱DNA聚合酶:此酶是從耐熱細菌中分離出來的,能耐受高溫(93~100℃)。
(3)10x PCR緩沖液:500mm01/LKCl; 100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20c),150mmol/LMgCl2,lmg/m1明膠。
(4)5mmo1/LdNTP貯備液:將dATP,dCTP,dGTPT和dTTP鈉鹽各100mg合并,加3m1滅菌去離子水溶解,用NaOH調pH至中性,分裝每份300v1,-20℃保存,dNTP濃度最好用uv吸收法精確測定。
(5)標本處理試劑:不同標本所需試劑不同,根據具體情況而定。
二、操作程序
利用PCR擴增的操作程序基本相同,只是根據引物與靶序列的不同,選擇不同的反應體系與循環參數,基本的操作是將PCR必需反應成分加入一微量離心管中,然后置于一定的循環參數條件下進行循環擴增。每個實驗室或每個人都有不同的操作習慣,但需遵守一定的操作規范。推薦下述操作程序,因這樣操作可最大程度地增加反應的成功率。
(1)向一微量離心管中依次加入:
ddH2O補至終體積(終體積50~100ul)
10xPCR緩沖液1/10體積
dNTP各200umol/L
引物各1umol/L
DNA模板
混勻后,離心15s使反應成分集于管底。
(2)加石蠟油50~100ul于反應液表面以防蒸發。置反應管于97c變性7min(染色體DNA)或5min(質粒DNA)。
(3)冷至延伸溫度時,加入1~5UTaqDNA聚合酶,在此溫度作用1min。
(4)于變性溫度下使模板DNA變性適當時間。
(5)在復性溫度下使引物與模板雜交一定時間。
(6)在延伸溫度下使復性的引物延伸合適的時間。
(7)重復(4)~(6)步25~30次。每次即為一個PCR循環。
(8)微量瓊脂德凝膠電泳檢查擴增產物。