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柱離心法純化質粒DNA
[2015/9/21]
實驗原理:
1.離心柱結構:特殊硅基質吸附材料,特異性吸附DNA,而RNA與蛋白質穿過。在正常情況下,核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜,以維持其水溶性。高濃度鹽離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對有序排列,形成了疏水環境。在此環境中,核酸與硅膠膜能有效結合,而蛋白質、代謝產物和其他污染物則不能結合。
2.堿變性抽提的原理是在pH高于12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,破壞了堿基配對,導致雙螺旋結構解開而變性,但閉環的質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當pH調至中性時,質粒DNA鏈迅速恢復到原來構型,仍保存于溶液中。而變性的染色體DNA不能再復性,通過離心,隨不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來,使兩者得以分離。
實驗試劑:
1.試劑盒自帶溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
2.漂洗液
3.結合緩沖液
4.洗脫緩沖液
5.TE buffer
實驗設備:
1. 吸附柱
2. 取液槍
3. 離心機
4. 低壓電泳儀
5. 水平電泳槽
6. 紫外透射儀
實驗材料:帶有質粒的大腸桿菌
實驗步驟:
1.培養細菌:將帶有質粒的大腸桿菌接種到1.5~3ml含有相應抗生素的液體培養基,37℃培養12~16小時;
2.取液體培養液3ml(1.5mlX2)于離心管中,10000r/min離心1min,去掉上清液,加入100ml 溶液I,充分混勻;置冰上;
3.加入150ml溶液II,加蓋顛倒6~7次使之混勻,冰上放置1~2min;
4.加入150ml溶液III,加蓋后顛倒6~7次混勻,冰上放置5min;
5.用臺式高速離心機,12000r/min離心10min;
6.吸附柱中加入420ul結合緩沖液,將步驟5中的上清轉移至吸附柱中,蓋上收集管的蓋子,混勻,12000r/min離心1min;
7.取下吸附柱,倒掉收集管中的液體,吸附柱放回同一收集管,向吸附柱中加入600ul漂洗液,靜置1min,12000r/min離心30s;
8.重復步驟7一次;
9.取下吸附柱,倒掉收集管中的液體,吸附柱放回同一收集管,12000r/min離心2min;
10.吸附柱放入一個新的1.5ml離心管,在吸附柱的中央加40ul洗脫緩沖液或TE buffer,室溫放置3~5分鐘。蓋好蓋子12000rpm離心1分鐘,收集質粒DNA溶液。
11.取5ul電泳檢查,(100ml凝膠加入5ul染料)。
注意事項:加樣時要排出槍頭中的空氣,以免攪動液面。