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基因組DNA提取純化的注意事項
[2015/12/23]
組織樣本DNA純化
大多數動物組織可以用裂解緩沖液和蛋白酶/蛋白酶K進行高效裂解。在加入裂解液之前需要將組織切成小塊,有條件的話建議使用TissueLyser或研缽等提前進行均質化。骨骼肌,心臟,皮膚等組織含有收縮蛋白,結締組織和膠原蛋白,所以利用蛋白酶/蛋白酶K進行充分消化是必須的。
FFPE樣本進行DNA純化時需要預裂解。福爾馬林可由PBS洗滌除去,石蠟可由二甲苯和乙醇進行去除。在蛋白酶消化后提高孵育的溫度有助于逆轉交聯,以便更好的從FFPE組織中釋放DNA,從而有助于提高DNA產量和改善下游檢測性能。 從FFPE中得到的DNA通常比從新鮮或凍存樣本中得到的DNA分子量小;DNA降解的程度則取決于樣本類型,儲存時間和固定的條件。
從微量樣本中純化DNA
微量樣本中DNA的含量很低,通常小于5ngDNA,通常需要使用carrier RNA來提高產量(不會影響下游分析檢測)。如果需要使用carrier RNA,那么在測量OD的時候會因為使用carrier RNA造成濃度測量有偏差(因為RNA在260nm也有吸收)。
推薦使用QIAamp DNA Micro Kit從微量樣本中進行DNA純化,該試劑盒采用 MinElute硅膠膜柱,洗脫體積可以低至20μl,同時通過兩步洗滌去除PCR抑制劑等污染物,最大程度從微量樣本中純化DNA。
從血液樣本中純化DNA
血液樣本可以是新鮮或凍存全血或干血片,由于血液樣本在采集后會迅速凝固,所以通常在采血時使用EDTA,檸檬酸鹽或肝素進行抗凝。經過抗凝處理的血液樣本可以直接用于 DNA純化,需要注意的是使用的DNA純化方法需要能夠去除上述抗凝劑,以免干擾下游 PCR檢測。全血也可以在DNA純化前先進行白細胞富集等再進行DNA純化。
從血液中純化DNA的產量很大程度上取決于血液中的白細胞數量,而白細胞數量則和血液的供體情況有很大關聯(如貧血或感染都會造成白細胞數量變化)。上述情況必須在進行DNA純化前就應該考慮到。此外,有些動物有有核血,這意味著這類樣本中含有更多的 DNA,在從此類血樣中純化DNA,上樣量需要減少10倍左右。
從細胞中純化DNA
哺乳動物細胞可以使用蛋白酶K進行裂解。
酵母細胞需要首先使用溶菌酶對細胞壁進行處理,然后使用蛋白酶或蛋白酶 K 進行消化。
許多細菌細胞可以使用裂解buffer和蛋白酶/蛋白酶K進行裂解,某些細菌如革蘭氏陽性菌需要預先使用溶菌酶對細胞壁進行處理。
細菌細胞需要先從生物體液中沉淀,然后從中純化細菌DNA,拭子樣本需要先使用殺菌劑進行預處理然后再離心。
使用機械裂解會比用酶消化的效果要好,尤其是針對革蘭氏陽性菌或真菌而言。