1、將標準品和樣品對應的微孔編號，每個標準品和樣品做雙孔平行，并記錄標準品和樣品的位置。

　　2、在標準品孔中加入50l各標準品溶液，酶標儀在各樣品孔中加入50l樣品溶液。

　　3、在所有孔中加入50l的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光反應30分鐘。

　　4、小心揭開蓋板膜，甩干孔中液體，用稀釋好的洗滌液（250μl/孔）充分洗滌微孔板3次，在吸水紙上拍干（拍干后未清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

　　5、酶標儀在所有孔中加入100l的酶標二抗，酶標儀用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光反應30分鐘。取出酶標板，按步驟4洗板5次。

　　6、洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50l底物液A，再加50l底物液B，輕微晃動反應板使之徹底混勻，25℃環境避光顯色15分鐘(在顏色淺的情況下可適當延長反應時間，但總顯色時間不要超過30分鐘)。

　　7、每孔中加入50l終止液，輕輕晃動使之徹底混勻，在450nm（建議使用雙波長450/630nm）下檢測吸光度，結果在5分鐘內讀取。