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分光光度計的原理及使用注意事項

[2017/5/27]

分光光度計是實驗室常規分析設備,主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。它利用光譜分析方法對樣品進行定性、定量分析,在現代分子生物實驗室中常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量等。分光光度計又稱光譜儀(spectrometer),是采用一個可以產生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。測量范圍一般包括波長范圍為380~780 nm的可見光區和波長范圍為200~380 nm的紫外光區。不同的光源都有其特有的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源。

核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應的系數。

蛋白質的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。該方法適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。

比色法蛋白質定量
比色法測定的基礎是蛋白質構成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨
基酸數目直接相關,從而反應蛋白質濃度。比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。

細菌細胞密度(OD 600)
OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液,之后定量培養后的含菌培養液。為了保證正確操作,必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數,做出校正曲線。需要注意的是,測試的樣品不能離心,保持細菌懸浮狀態。

分光光度計屬于精密儀器,應當妥善保管和精心維護,這樣才能保證分光光度計長期使用、長期的穩定可靠、測量精度高。

分光光度計使用注意事項
1. 使用儀器前,使用者應該首先了解本儀器的結構和工作原理,以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前,應該對儀器的安全性能進行檢查。
2. 指針式儀器尚未接通電源時,電表指針必須位于零刻度上,若不是這種情況,則可以用電表上的校正螺絲進行調零。
3. 儀器在制造廠原包裝條件下,應儲存在環境溫度為5℃~35℃,濕度不超過85%的室內,且在空氣中不應有足以引起腐蝕的有害物質。
4. 儀器工作環境應在在干燥的房間內,使用時放置在堅固平穩的工作臺上,室內照明不宜太強。
5. 比色皿使用完畢后,請立即用蒸餾水沖洗干凈,并用干凈柔軟的紗布將水跡擦去,以防止表面光潔度被破壞,影響比色皿的透光率。
6. 比色杯的配套性問題。比色杯必須配套使用,否則將使測試結果失去意義。
7. 鑒于儀器在出廠之前已經調試到最佳狀態,所以用戶不能擅自調整,更不能擅自打開機殼拆卸其中的零件(更換光源燈除外),尤其是拆卸單色器、不能碰傷或擦拭光學原件鏡面。
8. 如有故障急需自修,應在廠方技術人員同意指導下,請具有相應資質的專業人員進行檢查、調整和維修,建議返修。

美譜達在光度計的方法學應用、產品機械結構、光學設計、電氣應用和軟件開發等方面不斷開拓創新,相繼推出UV/Vis-1系列紫外/可見分光光度計,UV-3系列掃描型紫外/可見分光光度計,UV-6系列雙光束掃描型紫外/可見分光光度計,以滿足各類實驗室對分光光度計產品的不同需求,受到國內外用戶的普遍好評。


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