至少對(duì)于某些理論學(xué)家來說，生命的最初形式就是RNA。生命可能源自自我復(fù)制的RNA分子，而分子生物學(xué)家卻長期將目光放在DNA上。但這一偏見確實(shí)有不錯(cuò)的理由。DNA不僅被廣泛認(rèn)為攜帶著生命指令的決定性拷貝，而且也更易于在實(shí)驗(yàn)室操作。

　　如今，這兩個(gè)合理解釋都土崩瓦解了。基于非蛋白編碼部分RNA的一整層基因調(diào)控模式的發(fā)現(xiàn)，以及同期發(fā)展起來、操作這些分子的新工具和新技術(shù)，已經(jīng)激起了人們對(duì)理解和探索RNA世界的濃厚興趣。在過去的幾年間，這一領(lǐng)域的創(chuàng)新包括了從解決簡單問題如制備今后分析所需的RNA保存制劑，到開拓全新的前沿如對(duì)單細(xì)胞中所有RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序的方法。這種方法單刀直入，一些研究者甚至開始用它來代替轉(zhuǎn)錄本分析的芯片法。同時(shí)，為了提高可靠性，有些已經(jīng)成型的技術(shù)也已得到徹底的革新，如利用小片段干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)來進(jìn)行基因沉默的技術(shù)。

　　解碼信息

　　研究RNA的基礎(chǔ)性進(jìn)展始于2008年，當(dāng)時(shí)研究者描繪的技術(shù)是測定一群細(xì)胞中的全部轉(zhuǎn)錄本。這種RNA-Seq的測序方法需要對(duì)純化過的信使RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后利用下一代測序工具來測定所有產(chǎn)生的cDNA。結(jié)果是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的完全序列。

　　整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的測序非常強(qiáng)大，然而最初版本的RNA-Seq也存在著一些限制。“2009年，我們最初的RNA-Seq試劑盒需要至少一微克的RNA，而且需要高質(zhì)量的(RNA)，否則你無法得到好結(jié)果。”位于加利福尼亞州圣地亞哥市Illumina的杰出科學(xué)家Gary Schroth表示。

　　Illumina自此開始精煉步驟，現(xiàn)在提供的RNA測序試劑盒已可以使用少至100納克的RNA，這樣就使研究人員能夠測定小塊組織樣本中的轉(zhuǎn)錄組。該公司也提供去除核糖體RNA的試劑，核糖體RNA是困擾第一代RNA-Seq技術(shù)的主要污染物之一。

　　在一項(xiàng)被稱為Smart-Seq的技術(shù)演化中，研究者甚至可以設(shè)法測出單個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組。“如果在若干年前，一說到能夠做單細(xì)胞(RNA測序)，這種想法我會(huì)說‘不可能’，但當(dāng)你有一個(gè)分離的、自由懸浮的細(xì)胞時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)實(shí)際上達(dá)到這種水平也并非難事。”Schroth說。Smart-Seq對(duì)于粗雜的組織制備沒有作用，因此RNA-Seq仍然是研究這些樣品的最好方法。

　　隨著轉(zhuǎn)錄組測序持續(xù)發(fā)展，測序成本持續(xù)下降，很多生物學(xué)家現(xiàn)在開始使用RNA-Seq技術(shù)來進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)錄組分析，這一工作以前留給RNA分析芯片來完成。芯片通過將RNA與短寡聚核苷酸組成的微陣列進(jìn)行雜交，來確定存在哪些轉(zhuǎn)錄本。盡管這一方法多年來一直是轉(zhuǎn)錄組分析的主力軍，它卻只能夠鑒定出芯片制造者預(yù)測到的細(xì)胞可產(chǎn)生的RNA序列。由于 RNA-Seq技術(shù)的非偏倚性，它常常會(huì)顯示出可變剪切的RNA形式和全新的轉(zhuǎn)錄本，而這些在芯片中卻無法顯示，研究者可以就此對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘。 Schroth所在的公司可以制造這兩種分析類型的儀器，他聲稱，芯片在一些涉及大量樣本的研究中仍然具有優(yōu)勢(shì)。

　　不管生物學(xué)家使用的轉(zhuǎn)錄分析策略如何，他們敏銳地意識(shí)到轉(zhuǎn)錄并不能確保一個(gè)基因產(chǎn)物的表達(dá)。尤其是RNA干擾(RNA interference，RNAi)系統(tǒng)產(chǎn)生的大量短的RNA片段能夠結(jié)合表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，并且靶向進(jìn)行破壞。研究人員最初想通過對(duì)細(xì)胞中短片段RNA群體進(jìn)行測序，并對(duì)不同序列的相對(duì)豐度進(jìn)行定量，進(jìn)而研究這一系統(tǒng)。這證明是比較棘手的。

　　“我們通過一些體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些小RNA的細(xì)胞群體在測序文庫的呈現(xiàn)并沒有其他的好。”位于馬薩諸塞州伊普斯維奇的新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室的資深科學(xué)家Brett Robb說。尤其是許多動(dòng)物和植物細(xì)胞修飾了它們小RNA的3’末端，這樣，標(biāo)準(zhǔn)的測序方法將不足以展現(xiàn)出這些修飾過的分子。為了解決這一問題，Robb 和他的同事優(yōu)化了一種基于連接反應(yīng)的技術(shù)，該技術(shù)能在測序前將一個(gè)特定修飾過的DNA接頭連接到小RNA上。

　　當(dāng)科學(xué)家繼續(xù)深入研究轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)了額外的RNA類型。Robb說：“在我們研究小RNA時(shí)，很多我們了解到的事情都將對(duì)一些新興事物有所助益，例如最近非常火的長非編碼RNA( long noncoding RNAs，lncRNAs)。”

　　lncRNAs是超過200個(gè)核苷酸的RNA片段，它們不編碼蛋白質(zhì)，但反倒以多種方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯。在大規(guī)模的測序計(jì)劃中，科學(xué)家估計(jì)人類基因組至少編碼數(shù)以萬計(jì)的lncRNAs，意味著這些分子代表了基因調(diào)控的另一主要層次。

　　lncRNAs是雙鏈的，可由基因組DNA的任意一條鏈進(jìn)行編碼。這為早期的lncRNA研究者帶來了主要問題，他們經(jīng)常難以找出某個(gè)lncRNA來源于哪條DNA鏈。現(xiàn)在，NEB公司為此開發(fā)了一個(gè)名為NEBNext Ultra的試劑盒，生產(chǎn)鏈特異性的測序文庫。

　　沉默的片刻

　　除了測序并研究非編碼RNA之外，研究人員也在將其用于探究基因的功能。利用合成siRNA寡核苷酸瞬時(shí)阻斷目標(biāo)蛋白的表達(dá)已成為標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，藥物研發(fā)人員也開始繼續(xù)探索使用RNA干擾機(jī)制治療疾病的方式。

　　的確，基于RNA干擾的治療法與許多生物制藥產(chǎn)業(yè)所采用的技術(shù)遵循著同樣的循環(huán)。“當(dāng)人們發(fā)現(xiàn)RNA干擾時(shí)，當(dāng)然是十分興奮的，而后又會(huì)經(jīng)歷跌宕起伏，然后RNA干擾又興起了。”位于加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司RNA干擾技術(shù)部高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理Nitin Puri說。

　　最初能夠瞬時(shí)關(guān)閉任何基因表達(dá)的希望很快就被現(xiàn)實(shí)取代了，研究人員發(fā)現(xiàn)他們的合成siRNA分子常常靶向多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，并且往往缺乏傳統(tǒng)藥物的效力。在最初的失望之后，該領(lǐng)域又開始逐漸恢復(fù)，研究人員開始解決其中的一些問題。“在過去的兩到三年間，我們看到研究者已經(jīng)(對(duì)siRNA)更有興趣，因?yàn)樗麄円庾R(shí)到該技術(shù)如何幫助他們真正洞察并理解高通量篩選。”Puri說。

　　人們開始使用改進(jìn)的寡核苷酸設(shè)計(jì)算法和化學(xué)標(biāo)記，例如，生命技術(shù)公司現(xiàn)在能夠合成應(yīng)對(duì)單個(gè)或多個(gè)基因的有效、特定siRNA。通過用這些新的siRNA進(jìn)行高通量篩選，科學(xué)家可以快速縮小可能與特定表型相關(guān)的基因列表。

　　但即便是很好的高通量篩選還是會(huì)產(chǎn)生大量的誤差，通常會(huì)標(biāo)記出許多與研究者研究表型不直接相關(guān)的基因。篩選數(shù)據(jù)的新策略可能會(huì)有所幫助。“我們與研發(fā)新方法的研究者合作，特別是生物信息學(xué)方法，來清除不必要的基因。”Puri說。

　　研究人員也學(xué)會(huì)了讓自己對(duì)siRNA的期望更加現(xiàn)實(shí)　。“那些使用RNA干擾并且在這一領(lǐng)域研究多年的科學(xué)家開始理解，并更加接受它的天然缺陷。”位于馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾公司高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理Louise Baskin說，“機(jī)制本身就很混亂，我們盡力讓它變得更具體，但經(jīng)常還是會(huì)有不可預(yù)料的事情發(fā)生。”

　　即使一些針對(duì)重要基因產(chǎn)物的高特異性siRNA分子也無法產(chǎn)生表型，但生物學(xué)家早已清楚知道其中的原因。“逐個(gè)攻破基因的困擾之一在于我們的細(xì)胞非常聰明，它們具有次生通路和冗余的機(jī)制來拯救自己。”Baskin說。為了最大化siRNA篩選成功的幾率，她建議使用針對(duì)一個(gè)通路中多個(gè)基因靶點(diǎn)的一套siRNA，而非只用一個(gè)。賽默飛世爾公司提供預(yù)制的siRNA文庫來支持這一策略，這些文庫能夠靶向人類、大鼠或者小鼠中的任何已知基因，而且這家公司近期也新增了針對(duì)長非編碼RNA的siRNA文庫。

　　對(duì)于想要在原生細(xì)胞或整個(gè)組織中進(jìn)行操作的研究者來說，僅僅讓siRNA分子接近靶標(biāo)也會(huì)產(chǎn)生麻煩，因?yàn)檫@些細(xì)胞通常會(huì)抵抗傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法。為了解決這一問題，賽默飛世爾公司研發(fā)了一套自我遞送的siRNA系，攜帶的化學(xué)修飾會(huì)允許它們直接進(jìn)入細(xì)胞。

　　快速敲除

　　合成的siRNA為瞬時(shí)調(diào)低基因表達(dá)提供了便捷的方式，而要找尋持久影響的研究人員則往往會(huì)轉(zhuǎn)向那些編碼短發(fā)卡RNA(short hairpin RNAs，shRNA)的DNA載體。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了這些載體之一的細(xì)胞在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄了短發(fā)卡RNA，并在其中通過自身的RNA干擾機(jī)制去形成應(yīng)對(duì)特異性轉(zhuǎn)錄本的siRNA。載體在細(xì)胞中持續(xù)存在，從而就能永久地沉默目標(biāo)基因產(chǎn)物。

　　通過將靶向不同轉(zhuǎn)錄本的一組 shRNA混在一起，研究者能夠產(chǎn)出一群細(xì)胞，其中每個(gè)細(xì)胞都有一個(gè)不同基因被沉默。通過分離展現(xiàn)出所需表型的細(xì)胞，并對(duì)它們攜帶的載體進(jìn)行測序，就能提供出可能參與到那個(gè)表型的快捷基因圖譜。這種混合池的方法極大地降低了高通量shRNA篩選的成本和復(fù)雜性。“不同于將一個(gè)shRNA放入一個(gè)細(xì)胞孔中觀測結(jié)果，你可以將許多甚至上千個(gè)shRNA一次性放入整板的細(xì)胞中，如果你的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和執(zhí)行夠仔細(xì)…你將能在更低的成本和更快的速度下迅速篩選出大量的基因。”位于密蘇里州圣路易斯市的西格瑪生命科學(xué)公司功能基因組細(xì)分市場經(jīng)理Shawn Shafer說。

　　為了助力分析工作，布羅德研究所RNA干擾共同體的科學(xué)家已經(jīng)制出了靶向15000個(gè)人類和15000個(gè)小鼠基因的shRNA文庫。這些shRNA被打包在能夠轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞的慢病毒基因載體中。目前，西格瑪公司和賽默飛世爾公司都為研究者提供這樣的文庫。現(xiàn)在，這一共同體正試著研制至少兩個(gè)高效、經(jīng)過驗(yàn)證的基于 RNA干擾抑制子，不僅針對(duì)每個(gè)人類和小鼠的基因，而且也針對(duì)長非編碼RNA。這些試劑將會(huì)讓高通量遺傳篩選更加容易。

　　隨著方法的提升，研究人員也開始揭開新的難題。近期關(guān)于RNA干擾機(jī)制的數(shù)據(jù)顯示，一個(gè)僅有7個(gè)核苷酸長度的小“種子序列”可能決定著小RNA的特異性。這將有助于解釋許多siRNA和shRNA抑制子含混不清的效應(yīng);一個(gè)七堿基的序列與22堿基序列相比，能夠潛在結(jié)合更多的轉(zhuǎn)錄本。“他們目前所做的混合池篩選需要兩個(gè)或三個(gè)對(duì)應(yīng)同一轉(zhuǎn)錄本的shRNA作為采樣數(shù)，某種程度上可以充當(dāng)最初采樣的重新驗(yàn)證。”Shafer說。

　　西格瑪公司也提供采用siRNA實(shí)驗(yàn)相同方法的試劑盒。在該公司的EasyRNA方案中，實(shí)驗(yàn)者可以擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄本的片段，并將它變成覆蓋整個(gè)片段的siRNA混合池。以定制的多重siRNA去靶向轉(zhuǎn)錄本可能會(huì)有助于在最小化脫靶影響的同時(shí)使沉默最大化。

　　為長期基因沉默設(shè)計(jì)高效的shRNA是一項(xiàng)更為艱巨的任務(wù)。最初，生物學(xué)家僅僅借用了他們用來設(shè)計(jì)合成siRNA的算法，并將其應(yīng)用在shRNA載體上。這個(gè)效果并不明顯。“如果你放入一條(siRNA)序列，并試著在一個(gè)載體中表達(dá)它，你將在功能上得到大量的變異性。”位于阿拉巴馬州亨茨維爾的 TransOMIC公司高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理Andy Crouse說。

　　同一序列在siRNA和shRNA間的性能差異可能來源于它們?cè)诩?xì)胞中差異頗大的通路。Crouse解釋道，當(dāng)shRNA被轉(zhuǎn)錄并進(jìn)入與自身RNA干擾系統(tǒng)相同的細(xì)胞機(jī)制時(shí)，合成的siRNA繞過了這一途徑的大部分，并直接與它們的靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本相結(jié)合。

　　一段時(shí)間以來，圍繞這一問題，科學(xué)家簡單地通過使用多重shRNA載體針對(duì)每個(gè)想要沉默的轉(zhuǎn)錄本，希望其中一個(gè)或者組合起來能夠達(dá)到較好的效果。做混合池shRNA篩選的能力最終幫助研究者從一個(gè)大的分組中分離大部分有效的shRNA。分析有效的shRNA混池帶來了新的算法，能夠準(zhǔn)確地預(yù)測沉默給定靶標(biāo)最恰當(dāng)?shù)膕hRNA序列。TransOMIC公司現(xiàn)在使用這一算法設(shè)計(jì)shRNA的定制套系，同時(shí)也預(yù)建了靶向特定基因家族的shRNA文庫。

　　隨著非編碼RNA的研究技術(shù)不斷發(fā)展，該領(lǐng)域的專家也看到了RNA世界的美好未來。“人類的復(fù)雜性并不能通過我們比例較小的蛋白編碼基因來解釋……我們所擁有的復(fù)雜性存在于我們基因組中會(huì)轉(zhuǎn)錄為RNA、但永遠(yuǎn)也不會(huì)產(chǎn)生蛋白的那部分比例中。”賽默飛世爾公司的Baskin說。她補(bǔ)充道：“我們?nèi)绾芜M(jìn)行研究，這對(duì)于我們對(duì)生物系統(tǒng)的理解意味著什么，這些問題實(shí)際上有無盡的可能性。”