來自美國霍華德休斯醫學研究所，Janelia研究園的科學家們，借助其發展的新光學超分辨率成像技術，在前所未有的高分辨率條件下研究了活體細胞 內的動態生物過程。他們的新方法顯著的提高了結構光照明顯微鏡(structuredilluminationmicroscopy，SIM)的分辨率， 一種最適合活體超分辨成像的技術。

　　新技術所拍攝的視頻生動地展現了細胞內蛋白質的運動和相互作用。它們幫助生物學家理解細胞是怎樣改變它們之間的依存結構，以及重整細胞膜結構使得細胞 外的分子可以被吸收到細胞內。來自Janelia研究園的研究員EricBetzig博士，李棟博士后和他們的同事們基于原有的SIM顯微鏡原理新發展了兩種新的超分辨率成像技術。超分辨率光學顯微成像技術能夠跨越理論的分辨率極限，在極高的分辨率下展現細胞內的精細結構。但是，到目前為止，超分辨率顯 微鏡技術卻依然不能進行有效的活體細胞成像。

　　“這些方法設立了超分辨率光學顯微鏡的成像速度和非侵入特性的新標準，它們使得超分辨率活體細胞成像成為現實。”Betzig博士說道。在傳統的 SIM顯微鏡中，物鏡下的物體被非均勻的結構光(類似于條紋碼)所照明。在實驗中，幾束不同的結構光用來照明物體，它們和物體在不同角度混頻所產生的摩爾 條紋被相機依次采集。然后計算機提取摩爾條紋編碼的信息并將其解碼生成三維的高分辨率圖像。最終重建的SIM圖像具有高于傳統顯微鏡圖像2倍的空間分辨率。 リンク： www.loyuki.comサッカーユニフォーム NEW ERA ニューエラ 激安販売 ナイキ激安

　　Betzig博士和其他兩位科學家因為發展超分辨率熒光顯微鏡而被授予2014年諾貝爾化學獎。他說道，SIM顯微鏡技術之所以沒有得到像其它方法那樣多的關注，是因為其它技術能夠提供比兩倍更高的分辨率改進效果。但是，他強調SIM擁有兩大其它的超分辨率方法所沒有的優勢。這些其它方法包括了兩種去 年獲得諾貝爾獎表彰的技術：他和同事HaraldHess博士于2006年開發的光激活定位顯微鏡 (photoactivatedlocalizationmicroscopy，PALM)，和受激輻射耗盡 (stimulatedemissiondepletion，STED)顯微鏡。但是，這兩種技術都需要過多或過強的光來照明樣品，以至于熒光蛋白很快被 漂白，細胞樣品很快被損害，從而不可能長時間進行成像。然而，SIM在這些方面不一樣，“我愛上了SIM，因為它的速度很快，而且它所需的照明光強度遠遠 小于其它方法。”Betzig博士說道。

　　Betzig博士在2011年MatsGustafsson博士去世后不久開始與SIM相關的研究。Gustafsson博士是SIM技術的先驅之一，生前也是Janelia的研究員。Betzig博士那時已經深信SIM有潛力為解析細胞內部的工作機理提供重要的見解，如果SIM的空間分辨率可以被提高，它對于生物研究的可用性將被大大增強。

　　在生前，Gustafsson博士和博士生HesperRego發展了一種利用飽和耗盡(saturateddepletion)的非線性SIM技術，但這種技術在改進分辨率的同時需要使用很多的光照并且散失了SIM成像速度快的優勢。Betzig博士想到了一種可以避免這些缺陷的方法。

　　飽和耗盡非線性SIM利用光可反復開關的熒光蛋白和其在開關過程中的飽和耗盡效應來提高分辨率。它產生圖像的過程是，首先把所有的熒光蛋白分子激活到 可發光的狀態(亮態)，然后用一束結構光把大部份的亮態分子反激活到暗態。通過結構光反激活之后，僅有少數處于結構光最弱區域的分子仍然保持在亮態。這些光調控過程提供了物體的高空間頻率信息，從而讓圖像更加清晰。這一過程需要重復25或更多次才能產生最終的高分辨率圖像。Betzig博士說道，這一原理 非常類似于STED或另一種與其相關的叫做RESOLFT的超分辨率技術的原理。

　　這一技術并不適合于活體成像，因為激活和反激活熒光蛋白需要很長的時間。另外，反復的光照明會對細胞和熒光蛋白本身造成損傷。Betzig博士說道，“這一技術的問題在于你首先用光激活了所有的熒光蛋白分子，然后你馬上又用另一束光反激活了大部份分子。這些被反激活的分子對最終的圖像沒有任何貢獻，但卻被你用光“油炸”了兩次。你讓分子承受了很大“壓力”，并且花了很多你并沒有的時間，因為這段時間內細胞在運動。”

　　解決方法其實很簡單，Betzig博士說道：“沒有必要激活所有的分子。”在Betzig研究小組新發展的結構光激活非線性SIM的技術中，一開始用結構光只激活樣品里的一部分熒光蛋白分子。“這一結構光激活過程已經給你一些高分辨率的信息了。”Betzig博士解釋道。另外一束結構光用于反激活分子，額外的信息可以在反激活的過程中同時被讀出。兩個結構光疊加的效應給與最終圖像62納米的分辨率，這一結果好于原始的SIM，并且把由光波長決定的傳 統分辨率極限改進了三倍。

　　“我們能夠做到快速地超高分辨率成像。”Betzig博士說道。這很重要，他補充道，因為對于動態過程，單純提高空間分辨率而沒有相應地提高成像速度 是沒有意義的。“如果細胞內部有的結構以1微米每秒的速度運動，并且我有1微米的分辨率，那么我需要在一秒內采集圖像。但如果我有1/10微米的分辨率， 那么我就必需在1/10秒內采集圖像，不然圖像將變得模糊。”Betzig博士解釋道。

　　結構光激活非線性SIM可在1/3秒內采集25幅原始圖像，并從中重建出一幅高分辨率圖像。它的圖像采集很高效，只需用較低的照明光強，并且收集每一 個亮態熒光蛋白分子所攜帶的信息。從而有效地保護了熒光分子，使得顯微鏡能夠進行更長時間的成像，讓科學家們可以觀測到更多的動態活動。

　　Betzig博士的團隊利用結構光激活非線性SIM獲得了在細胞運動和改變形狀的過程中骨架蛋白的解體和自身再組裝過程，以及在細胞膜表面的叫做caveolae的微小內吞體動態過程的影像。

　　在Science論文里，Betzig博士的團隊也利用了已經商業化的高數值孔徑物鏡將傳統SIM的空間分辨率提高到84納米。高數值孔徑限制了被光 照明的樣品范圍，從而降低了光對細胞以及熒光蛋白分子的損傷。這一方法可以同時對多個顏色通道進行成像，使得科學家們可以同時跟蹤幾種不同蛋白質的活動。

　　通過高數值孔徑的方法，Betzig博士的團隊觀測了多個骨架蛋白質在形成粘著斑(鏈接細胞內外的物理鏈)過程中的運動和相互作用。他們也追蹤了clathrin修飾的內吞體的成長和內吞過程(內吞體將細胞外的分子轉移到細胞內)。他們的定量分析回答了幾個不能被以往的成像技術所解決的問題，例如，內吞體的分布，以及內吞體尺寸和壽命之間的關系。最后，通過結合高數值孔徑方法和結構光激活非線性SIM，Betzig博士和他的同事可以在超高分辨 率條件同時追蹤兩種蛋白質的活動。

　　Betzig博士的團隊在進一步提高他們的SIM技術。他們也急切地盼望和生物學家一起探索潛在的應用并進一步改進這一技術的可用性。

　　現在，科學家們可以通過現在，科學家們可以通過JaneliaJanelia的高級成像中心利用這些新的的高級成像中心利用這些新的SIMSIM技 術，這個中心提供免費使用前沿的顯微鏡技術的機會。最后，技術，這個中心提供免費使用前沿的顯微鏡技術的機會。最后，BetzigBetzig博士說道，使得博士說道，使得SIMSIM成為能夠被其他實驗室獲得并能夠承擔的技術應該是比較直接的事。“大部份的‘魔術’在于軟件而不是硬件。”成為能夠被其他實驗室獲得并能夠承擔的技術應該是比較直接的事。“大部份的‘魔術’在于軟件而不是硬件。”