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PCR成分操作和選用的注意事項

[2015/1/15]

1) 水：必須是超純水。在1.5ml離心管內保存。
　　(2) Buffer (緩沖液)
　　? 不同公司，不同的DNA Polymerase，對應不同的Buffer。要清楚的區分。
　　? 切記要分裝，避免反復凍融。第一次從公司買來要分裝。一般是1ml。先250微升分裝到四個管內。然后取一個管，分裝50微升到五個管內。清楚標記。 ?
　　特別注意Buffer (緩沖液)是否有鎂離子。如果沒有需要額外添加。
　　(3) dNTP
　　不同公司，不同的DNA Polymerase，對應不同的dNTP，主要是融dNTP的溶液不同公司很有可能是不同的。要清楚的區分。
　　 切記要分裝，避免反復凍融。第一次從公司買來要分裝。一般是1ml。先250微升分裝到四個管內。然后取一個管，分裝50微升到五個管內。清楚標記。
　　(4) Primer (引物)
　　引物最核心，最重要的是特異性。學會如何利用基因組數據庫去判斷引物特異性。為了特異性，其他條件都是可以變動的。其他條件都是子滿足特異性的前提下考慮的。
　　一般長度為 23-35 個核苷酸。但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應 
　　理想的 GC 含量為 40-60%
　　計算的退火溫度(Tm)應在 50-65℃ 
　　兩條引物間 Tm 差值應在 5℃ 以內避免引物形成引物內二級結構(如發卡結構)以及引物二聚體
　　當引入限制性位點時，需要在識別位點 5' 端額外添加 4-6 個堿基。如果直接用PCR產物要進行酶切反應，要額外添加6 個堿基
　　 每條引物的終濃度應為 0.1-0.5 μM; 引物濃度過高可能導致非特異性引物結合，并產生非特異性擴增產物 ?
　　如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。 
      引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。
　　引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點;標記生物素、熒光、地高辛、Eu3 等;引入蛋白質結合DNA序列;引入點突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動子序列等。
　　引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。
　　(5) 模板：
　　 如論是總DNA還是質粒DNA純度要盡量高。對反應是否成功至關重要。如果組織量容許，用試劑盒提取總DNA。如果組織量少，用實驗室的手提方法。有兩個關鍵點：第一步加的提取液體積要過量，以便充分混勻。最后一步乙醇清洗要進行兩次;干燥要徹底，管內不能有液體。要用純水溶解。
　　如果DNA溶解不充分，可以在75-85度水浴中處理10-20分鐘，可以顯著促進溶解。
　　要知道自己模板的濃度。
　　模板量根據反應用的DNA Polymerase的要求確定。
　　如果PCR DNA產物用于分子克隆，適當提高模板量，這樣可以減低PCR反應的循環數，從而降低引入突變的幾率。
　　(6)DNA Polymerase (DNA聚合酶)
　　如果是常規檢測，目前是有 Takara Ex-Taq; 如果是分子克隆，用Takara Prime Star;純粹學習目的，使用 全式金Easy Taq，或是 Takara rTaq.
　　(7)建立好反應體系后立即放入已經預熱至變性溫度的熱循環儀中
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