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PCR操作步驟及注意

[2015/1/15]

  PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段,并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此,PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析,還可以用于突變體和重組體的構建,基因表達調控的研究,基因多態性的分析,遺傳病和傳染病的診斷,腫瘤機制的探索,法醫鑒定等諸多方面。
  PCR操作步驟:
  1.在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix (2mM) 4 μl 引物1(10pM) 2 μl 引物2(10pM) 2 μl Taq酶 (2U/μl) 1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
  2. 調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環30-35次,最后在72℃ 保溫7min。
  3. 結束反應,PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
  4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μl氯仿進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
  PCR注意事項:
  1.PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。最好設立一個專用的PCR實驗室。
  2.純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結果,純化的方法越簡單越好。
  3.所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
  4.PCR試劑配制應使用最高質量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
  5.試劑都應該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續性。
  6.試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
  7.PCR的樣品應在冰浴上化開,并且要充分混勻。

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